小麥根尖細(xì)胞中一種響應(yīng)鹽脅迫與細(xì)胞死亡相關(guān)的內(nèi)肽酶及其生化特性研究.pdf

1、鹽分是影響植物生長和產(chǎn)量的一個(gè)重要環(huán)境因子，鹽脅迫會(huì)降低水勢并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子失衡，產(chǎn)生毒害，從而導(dǎo)致植物生長量降低甚至死亡。而小麥根尖是植物最先感應(yīng)鹽脅迫的部位，它能夠使植株對此做出一系列的適應(yīng)性反應(yīng)。因此探索鹽脅迫下的小麥根尖細(xì)胞的生理生化性質(zhì)，尤其在蛋白質(zhì)水平的變化具有重要意義。
　　 內(nèi)肽酶（endopeptidase，簡稱EP，也稱蛋白酶）參與了調(diào)節(jié)植物衰老過程中蛋白質(zhì)的降解，而其活力在衰老期間顯著上升。本文以小麥（3E

2、-158）為材料，初步探討了在一定濃度的鹽脅迫下和不同濃度的Hemin（外源CO供體）緩解鹽脅迫下小麥根尖細(xì)胞的氧化損傷和蛋白降解情況，并深入研究了與鹽脅迫相關(guān)的內(nèi)肽酶同工酶的活性變化及其生化特性，主要研究結(jié)果簡述如下：
　　 我們采用200 mmol·L-1的NaCl對根長長至6～8cm的小麥開始進(jìn)行鹽脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥根長隨著鹽脅迫時(shí)間的延長明顯逐漸受到抑制，脅迫第4天根長僅為對照的68.9％；小麥根尖細(xì)胞中TBARS

3、含量在脅迫第一天達(dá)到了相應(yīng)對照（C）的2倍，此后隨著鹽脅迫時(shí)間的延長仍然維持在一個(gè)相對比較高的水平上；O2產(chǎn)生速率隨著處理時(shí)間的延長也呈現(xiàn)不斷的增高趨勢。采用相應(yīng)處理的小麥根尖進(jìn)行全基因組DNA電泳檢測分析，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫第2天，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯DNA Ladder，到第4天仍然發(fā)現(xiàn)有較模糊的Ladder現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，200 mmol·L-1的NaCl脅迫使小麥根生長受到抑制，對其生理生化活動(dòng)也已造成一定程度的傷害。
　　 為

4、研究鹽脅迫下小麥根尖細(xì)胞內(nèi)肽酶同工酶的變化情況，我們采用以明膠為底物的梯度凝膠電泳活性染色方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在200 mmol·L-1的NaCl脅迫第三天開始，有一種內(nèi)肽酶同工酶活性顯著增強(qiáng)，且隨著鹽脅迫時(shí)間的延長該酶活性繼續(xù)增強(qiáng)。對該酶進(jìn)行生化特性研究分析，發(fā)現(xiàn)該酶在pH3.0-10.0的較寬pH范圍內(nèi)和20℃-80℃較寬的溫度范圍內(nèi)均表現(xiàn)有活性，說明該酶生化性質(zhì)比較特殊，不僅能耐一定的酸堿，而且能耐一定的高溫。該酶最適pH為pH6.0

5、，最適溫度為40℃。繼續(xù)在pH6.0和40℃的反應(yīng)條件下對該粗酶液進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，發(fā)現(xiàn)在4℃-50℃保溫一小時(shí)后該酶活性維持不變。用內(nèi)肽酶抑制劑分析，顯示該酶活性明顯被絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑PMSF，金屬離子型內(nèi)肽酶抑制劑EDTA和EGTA所抑制，其中PMSF抑制作用最強(qiáng)。
　　 我們采用不同濃度的外源CO供體（Hemin）與200 mmol·L-1 NaCl共處理4 d后發(fā)現(xiàn)，在1μmol·L-1和5μmol·L-1 Hemi

6、n影響下，與無Hemin處理的鹽脅迫組相比，小麥根長相對增長了5.3％和1.3％，小麥根尖細(xì)胞內(nèi)TBARS含量分別降低了10.7％和13.6％，超氧根陰離子產(chǎn)生速率也分別下降了17.1％和28.2％，細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量則增加了41.3％和22.5％。而以上指標(biāo)在0.1μmol·L-1的Hemin影響下差異不顯著。當(dāng)我們采用10μmol·L-1和20μmol·L-1的較高濃度Hemin處理鹽脅迫下的小麥，以上指標(biāo)非但未呈現(xiàn)出緩解現(xiàn)象，

7、反而有加劇損傷的趨勢。因此我們推斷，1μmol·L-1和5μmol·L-1 Hemin應(yīng)該是緩解鹽脅迫下小麥根尖細(xì)胞死亡的合適濃度，而其中尤以5μmol·L-1最為顯著。采用以明膠為底物的梯度凝膠電泳活性染色方法研究Hemin對鹽脅迫下小麥根尖細(xì)胞內(nèi)肽酶EP活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.1μmol·L-1、1μmol·L-1和5μmol·L-1 Hemin處理下，內(nèi)肽酶EP活性均有降低，其中更以0.1μmol·L-1和5μmol·L-1的H