牛肺泡巨噬細(xì)胞microRNA的克隆鑒定及microRNA 21真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的小分子單鏈非編碼RNA，長度約22nt，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3'-UTR區(qū)結(jié)合，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。研究表明，這些miRNA作為一種真核生物體內(nèi)的重要的調(diào)節(jié)因子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，并

2、影響著生物體生命活動的各個方面，目前已證實miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。雖然目前通過實驗和計算信息學(xué)的方法在植物和動物中發(fā)現(xiàn)了眾多miRNA分子，但是在各個物種中所鑒定的miRNA的數(shù)量遠(yuǎn)不及理論上的飽和值，所以對miRNA的分離鑒定依然是miRNA研究的一個重點和熱點。
　　 牛肺泡巨噬細(xì)胞是胞內(nèi)寄生菌(如牛結(jié)核分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌等)的主要靶細(xì)胞，

3、在胞內(nèi)寄生菌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，肺泡巨噬細(xì)胞的增殖與凋亡對于胞內(nèi)寄生菌的侵襲與在細(xì)胞內(nèi)存活起著決定性的作用，有關(guān)miRNAs在牛肺泡巨噬細(xì)胞抗菌機(jī)制中的作用尚未見到報道。本研究通過分離純化牛肺泡巨噬細(xì)胞，提取miRNA，構(gòu)建miRNA cDNA文庫，克隆測序牛肺泡巨噬細(xì)胞miRNA分子，以期發(fā)現(xiàn)在牛肺泡巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNA分子，為后期研究miRNA分子對牛肺泡巨噬細(xì)胞抗菌活性的調(diào)節(jié)機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　 研

4、究內(nèi)容如下：
　　 1、利用從牛肺泡巨噬細(xì)胞中分離得到的microRNA分子，構(gòu)建了兩個miRNAcDNA文庫，并挑取了438個克隆，測序后，利用NCBI中的Blastn(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)、miRBase數(shù)據(jù)庫(http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences/)和牛的基因組數(shù)據(jù)庫(http：//www.hgsc.bcm.tmc.edu/projec

5、ts/bovine/)對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，共篩選出22個miRNAs，其長度在19-25 bp，個別的長度為16-17bp，都能夠在?；蚪M中找到相應(yīng)的位置。
　　 2、首次建立了牛肺泡巨噬細(xì)胞miRNA cDNA文庫，并從中發(fā)現(xiàn)19個新的miRNAs分子，其中有8個miRNAs與人和(或)鼠中的序列完全同源，因此，將它們命名為Bta-miR-141、Bta-miR-187、Bta-miR-191、Bta-miR-448、B

6、ta-miR-589、Bta-miR-873、Bta-miR-463和Bta-miR-562。另外有11個miRNAs在所有miRBase數(shù)據(jù)庫中都沒有發(fā)現(xiàn)，其功能尚屬未知，有待進(jìn)一步研究。
　　 3、通過對克隆得到的與人和(或)鼠中的序列同源的miRNAs表達(dá)簇和靶基因的生物信息學(xué)分析，為研究牛肺泡巨噬細(xì)胞中microRNA的協(xié)同轉(zhuǎn)錄(bta-mir-191與bta-mir-425，bta-mir-141與bta-mir-20

7、0c位于同一簇上，轉(zhuǎn)錄時協(xié)同表達(dá))以及網(wǎng)狀調(diào)控(miR-448和miR-873以編碼miR-155的基因為靶點)等提供了有用信息。
　　 4、在對miR-21靶位點的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-21不僅對細(xì)胞的增殖與分化有調(diào)控作用，而且與腫瘤的發(fā)生、T細(xì)胞和B細(xì)胞的成熟密切相關(guān)，推測其在肺泡巨噬細(xì)胞的抗菌機(jī)制中起著重要作用。本研究利用線性載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR，成功構(gòu)建了microRNA21真核表達(dá)載體。不僅