核呼吸因子-1基因的克隆,真核表達及鑒定.pdf

1、目的：克隆NRF-1基因，并對NRF-1基因進行生物信息學分析，了解其基本結(jié)構(gòu)和蛋白分子特征，及NRF-1與相關(guān)蛋白分子的作用關(guān)系，為后續(xù)研究NRF-1的功能及在心力衰竭的心肌細胞中作用機制提供實驗支持和研究思路。構(gòu)建NRF-1重組慢病毒，并感染大鼠心肌細胞（H9c2（2-1）細胞），然后篩選出穩(wěn)定上調(diào)表達NRF-1的陽性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細胞，為今后研究NRF-1基因?qū)λソ咝募〖毎恼{(diào)節(jié)作用及后續(xù)的基因治療打下基礎(chǔ)。
　　方

2、法：1.NRF-1的生物信息學分析：通過在線軟件EXPASY，PSSFinder，PSITE，SignalP，Swiss-model，STRING對NRF-1的氨基酸構(gòu)成，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)修飾位點，信號肽，三維結(jié)構(gòu)，以及與相關(guān)蛋白之間的作用關(guān)系進行分析預測。
　　2.NRF-1基因的克隆與鑒定：2.1NRF-1基因的克?。和ㄟ^生物合成與重疊延伸PCR技術(shù)克隆NRF-1基因，并重組于載體pMD18-T，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌

3、（E.coil DH5?）；2.2 NRF-1基因的鑒定：PCR及測序鑒定重組質(zhì)粒 NRF-1/pMD18-T序列正確性。
　　3.構(gòu)建NRF-1重組慢病毒與穩(wěn)定上調(diào)表達NRF-1的H9c2(2-1)細胞：3.1 NRF-1重組慢病毒的包裝與滴度測定：將NRF-1基因重組至pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP載體，利用lipofectamine2000將重組載體pLenti6.3-NRF-1-IRES2-EGFP與兩種

4、包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞中，包裝成重組慢病毒，并測定病毒滴度；3.2 NRF-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細胞的最適轉(zhuǎn)染濃度測定：用陰性病毒液按梯度感染H9c2（2-1）細胞，選出合適的MOI值；3.3陽性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細胞的最適抗生素濃度測定：將重組慢病毒按選出的MOI值感染H9c2(2-1)細胞，然后用Blasticidin按濃度梯度篩選轉(zhuǎn)染靶細胞，選出合適的篩選濃度；3.4陽性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細胞的鑒定：用抗生

5、素按照最適篩選濃度持續(xù)篩選轉(zhuǎn)染陽性的H9c2（2-1）細胞，獲得穩(wěn)定上調(diào)表達NRF-1的轉(zhuǎn)染陽性靶細胞，經(jīng)PCR，QPCR和Western blot鑒定轉(zhuǎn)染陽性靶細胞的NRF-1表達量。
　　結(jié)果：1.生物信息學分析表明NRF-1的蛋白質(zhì)分子量為57280.1 Da，等電點為5.28，分子式為C2498H3976N704O808S15，有534個氨基酸，其中46個堿性氨基酸，64個酸性氨基酸，148個極性氨基酸，191個疏水性氨基

6、酸。有46(Arg+Lys)個帶正電荷的殘基，有64(Asp+Glu)個帶負電荷的殘基，不穩(wěn)定系數(shù)為35.74，總的平均親水系數(shù)為–0.334，說明NRF-1是穩(wěn)定的親水蛋白；NRF-1蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊較多，且分布均勻；NRF-1有2個糖基化位點，5個蛋白激酶 C磷酸化位點，13個酪蛋白激酶 II磷酸化位點，9個端?；稽c，1個酰胺化位點，11個微體羧基端定位信號；STRING蛋白數(shù)據(jù)庫分析顯示N RF-1與10個因子

7、具有不同程度相關(guān)性。
　　2.重組質(zhì)粒NRF-1/pMD18-T經(jīng)測序鑒定，NRF-1基因序列與原始序列一致。
　　3.構(gòu)建出NRF-1重組慢病毒，病毒滴度是5.5×107 TU/ml；重組慢病毒轉(zhuǎn)染H9c2(2-1)細胞的合適 MOI值為100；陽性轉(zhuǎn)染H9c2（2-1）細胞的最適抗生素篩選濃度為3μg/ml；NRF-1重組慢病毒按MOI=100轉(zhuǎn)染H9c2(2-1)細胞，經(jīng)3μg/ml抗生素持續(xù)篩選后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H9

8、c2(2-1)細胞，PCR鑒定結(jié)果顯示慢病毒攜帶NRF-1插入靶細胞基因組，QPCR結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細胞的NRF-1的mRNA表達量比對照組細胞高2.25倍，Western blot結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細胞的NRF-1蛋白表達量比對照組細胞高1.28倍。
　　結(jié)論：1.生物信息學分析NRF-1的氨基酸構(gòu)成及蛋白分子特征，了解到NRF-1與相關(guān)蛋白分子的作用關(guān)系，以及這些因子的功能特點。
　　2.成功克隆出NRF-1基因，并獲