人泛素基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定.pdf

1、泛素(Ubiquitin，Ub)是一個(gè)由76個(gè)氨基酸組成的高度保守的多肽鏈。它在細(xì)胞中以非共價(jià)鍵方式或通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合。主要功能是參與蛋白質(zhì)降解，通過(guò)介導(dǎo)蛋白降解、改變蛋白的細(xì)胞定位、改變蛋白的酶活性、改變蛋白與蛋白的相互作用等方式影響其所結(jié)合蛋白的功能與活性。而蛋白質(zhì)降解異常又與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們已經(jīng)從分子機(jī)制上認(rèn)識(shí)和討論它們之間的關(guān)系。近年來(lái)泛素及其類似物已經(jīng)成為了分子生物學(xué)的研究熱

2、點(diǎn)之一。 本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中已發(fā)表的人泛素基因mRNA序列，借助Primer5.0設(shè)計(jì)了六對(duì)寡核苷酸引物，運(yùn)用引物搭橋法合成目的序列Ub。在克隆出人泛素基因(Ub)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-Ub并對(duì)Ub基因進(jìn)行了原核表達(dá)和純化，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)GenBank(登陸號(hào)：M17524)中公布的人泛素基因(Ub)序列設(shè)計(jì)特異性引物，用引物搭橋法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲

3、得228bp的DNA片段。 2．利用定向克隆的方法，以pGEX-4T-1為載體，利用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)，將純化的基因Ub克隆至pGEX-4T-1中，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-4T-Ub。經(jīng)酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步的序列分析確認(rèn)了其中Ub序列的正確性。 3．將原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-Ub，轉(zhuǎn)化至E．coli BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE分析，在約3