枯草桿菌新型表達(dá)系統(tǒng)和遺傳操作體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、枯草桿菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力強(qiáng)的特性和良好的發(fā)酵基礎(chǔ)，是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌外源蛋白較理想的宿主。但由于受自身分泌蛋白酶多、構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒不太穩(wěn)定等因素影響，其應(yīng)用受到一定的限制。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，枯草芽孢桿菌作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展迅速，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文旨在建立一套枯草桿菌高效表達(dá)和分泌系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)甲基對(duì)硫磷水解酶基因mpd在枯草桿菌中的高效表達(dá)和分泌，以解決其在原始菌株中表達(dá)存在

2、的一些問(wèn)題；同時(shí)本文亦對(duì)枯草桿菌同源重組和載體轉(zhuǎn)化等遺傳操作體系進(jìn)行了一些探索性研究。以mpd基因?yàn)閳?bào)告基因，構(gòu)建了一個(gè)新型的方便而高效的啟動(dòng)子探針pUC-mpd。構(gòu)建了枯草桿菌168的基因組DNA的啟動(dòng)子文庫(kù)，利用啟動(dòng)子探針從文庫(kù)中克隆了一系列啟動(dòng)子功能片段并比較了其在大腸桿菌中的啟動(dòng)子強(qiáng)度，得到了兩個(gè)克隆有強(qiáng)啟動(dòng)子片段的克隆pMPDP3和pMPDP29。測(cè)定并分析了重組載體pMPDP3和pMPDP29克隆到的兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子功能片段的序

3、列，分別為兩個(gè)功能未知基因ytkA和ywoF基因上游的啟動(dòng)子，mpd基因分別與ytkA和ywoF基因的信號(hào)肽編碼序列發(fā)生了融合表達(dá)。對(duì)兩個(gè)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及兩個(gè)基因與MPH的融合表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。ytkA基因表達(dá)產(chǎn)物的信號(hào)肽為脂蛋白信號(hào)肽，而ywoF基因表達(dá)產(chǎn)物的信號(hào)肽為分泌型信號(hào)肽。利用大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體pNW33N與mpd基因構(gòu)建了穿梭啟動(dòng)子探針pNW33N-mpd。利用該探針釣取啟動(dòng)子后可以不經(jīng)亞克隆而直接轉(zhuǎn)入枯草桿菌

4、測(cè)定和比較啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。利用穿梭啟動(dòng)子探針重新克隆了ytkA和ywoF基因的啟動(dòng)子與信號(hào)肽編碼序列，構(gòu)建了mpd基因穿梭表達(dá)載體pNYTM和pNYWM。將載體pNYTM和pNYWM轉(zhuǎn)入枯草桿菌1A751重組表達(dá)mpd基因。發(fā)現(xiàn)在枯草桿菌中，ytkA基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度遠(yuǎn)強(qiáng)于ywoF基因的啟動(dòng)子。1A751(pNYTM)的mpd重組表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞結(jié)合，而1A751(pNYWM)的mpd重組表達(dá)產(chǎn)物大部分分泌在發(fā)酵液上清中。利用ytkA基因的強(qiáng)

5、啟動(dòng)子和nprB基因的分泌型信號(hào)肽重新構(gòu)建了mpd基因的分泌表達(dá)載體pYNMK。將pYNMK轉(zhuǎn)入缺失了8種蛋白酶的枯草桿菌WB800，使mpd基因獲得了更高水平的分泌表達(dá)，91.4％的酶分泌在上清液中，表達(dá)量是出發(fā)菌株的10.8倍。進(jìn)而利用PCR方法克隆和融合了P<,43>啟動(dòng)子功能片段和nprB基因信號(hào)肽編碼序列，構(gòu)建了新的大腸桿菌-枯草桿菌分泌表達(dá)載體pP43NMK。將pP43NMK導(dǎo)入到枯草桿菌WB800獲得表達(dá)菌株WB800(p

6、P43NMK)，在P<,43>啟動(dòng)子的帶動(dòng)下，mpd基因在表達(dá)菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期都得到了持續(xù)性高效表達(dá)和分泌。在培養(yǎng)到96 h后培養(yǎng)基中積累的MPH達(dá)到53 mg／mL，酶活為27.132 U／mL。表達(dá)量是原始菌株28．3倍，上清液中的酶活提高了約945.4倍。對(duì)重組表達(dá)的MPH進(jìn)行了SDS-PAGE和酶譜分析，MPH在培養(yǎng)到96 h后有輕微的降解隨后保持穩(wěn)定，重組表達(dá)MPH具有天然活性。通過(guò)陰離子交換和電洗脫純化了MPH。通過(guò)

7、MALDI-TOF-MS測(cè)得的MPH的分子量與MPH的理論分子量基本吻合，為31.384 kDa。MPH經(jīng)HPLC-ESI-MS分析確認(rèn)其N(xiāo)-末端的序列為AAPQVR，從而證明重組表達(dá)MPH的信號(hào)肽已經(jīng)被正確切割，MPH實(shí)現(xiàn)了天然N-末端表達(dá)。以短短小芽孢桿菌B15的總DNA為模板，利用PCR技術(shù)克隆到其細(xì)胞壁蛋白基因串聯(lián)啟動(dòng)子和信號(hào)肽編碼序列，測(cè)序分析后提交至GenBank，登錄號(hào)為AY956423。重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該片段并在PCR產(chǎn)

8、物兩側(cè)引入BamHI和PstI酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物雙酶切后克隆至穿梭載體pP43NMK的相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建分泌表達(dá)載體pPl5MK，插入片段置于該載體中mpd基因的上游，并使信號(hào)肽編碼序列與去除了自身信號(hào)肽編碼序列的mpd基因閱讀框恰好融合。將pPl5MK導(dǎo)入枯草桿菌構(gòu)建表達(dá)菌株WB800(PP15MK)，在短短小芽孢桿菌啟動(dòng)子和信號(hào)肽元件的帶動(dòng)下，mpd基因能夠在表達(dá)菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期持續(xù)性高效分泌表達(dá)；發(fā)酵液在72 h酶活達(dá)到最高

9、值13.9 U／mL，是出發(fā)菌株鄰單胞菌M6表達(dá)量的14.5倍。 以毒素蛋白mazF基因?yàn)樾滦头聪蚝Y選標(biāo)記構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記同源重組載體pDGIEF，成功利用該載體實(shí)現(xiàn)了枯草桿菌淀粉酶基因amyE的刪除／插入失活和mpd基因在枯草桿菌amyE位點(diǎn)的插入整合表達(dá)。以枯草桿菌bpr基因的上游和下游序列為同源臂，構(gòu)建了新的通用的可拆卸型載體plEFBPR。進(jìn)一步構(gòu)建了bpr基因的in-frame刪除載體pIEFBPR-ID，實(shí)現(xiàn)了bpr基因

10、的不改變其閱讀框的基因內(nèi)部序列的刪除。本部分研究工作建立的通用型無(wú)標(biāo)記同源重組體系采用了與以往的類(lèi)似技術(shù)體系所不同的策略，打破了以往的無(wú)標(biāo)記同源重組體系的局限，是進(jìn)行枯草桿菌染色體分子生物學(xué)改造的方便而高效的工具。 通過(guò)將枯草桿菌模式菌株(供體菌)和野生的芽孢桿菌(受體菌)混合接觸培養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)了不可自我轉(zhuǎn)移的pUBll0衍生載體向受體菌的轉(zhuǎn)移并實(shí)現(xiàn)了mpd基因在野生芽孢桿菌中的表達(dá)。實(shí)現(xiàn)野生芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化一直是芽孢桿菌研究領(lǐng)域的一