家蠶抗核型多角體病毒相關(guān)蛋白及雌雄差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，桑蠶業(yè)無論在古代還是現(xiàn)代，在中國農(nóng)業(yè)中都占有重要地位。引起蠶病的毒病主要有核型多角體病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)、質(zhì)型多角體病毒和濃核病毒。其中NPV引起的膿病每年給桑蠶業(yè)造成的損失巨大。不僅如此，食物中的病毒也對食品安全造成嚴(yán)重威脅。作為NPV的天然宿主，家蠶與病毒的相互作用關(guān)系一直是眾多研究者關(guān)心的問題。在自然界中，有少數(shù)家蠶品系具有天然的抗病毒能力。盡管已經(jīng)有多種蛋

2、白或基因被報道有抵抗NPV的作用，但到今天為止，科學(xué)界還未確定哪種蛋白或基因決定了家蠶的抗NPV性狀，更不清楚家蠶抗NPV的詳細(xì)機制。另外，在雌雄家蠶之間有一些差異性狀，如雄蠶比雌蠶更健壯、不同齡期雄蠶與雌蠶的生長速率不一樣等，這其中的機制至今還不很清楚。如果能了解宿主抵抗病毒的機制，將會大大推動蠶業(yè)生產(chǎn)給，降低病毒給食品安全性帶來的風(fēng)險。
　　 本研究用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定家蠶中的抗病毒相關(guān)蛋白。用抗病毒品系NB、感病毒品系30

3、6和它們的雜交F1代來組配成正交組和反交組，比較各品系家蠶間的差異蛋白，希望能找出與抗病毒或感病毒相關(guān)的蛋白。另外，還用二維電泳技術(shù)分離雄蠶與雌蠶中腸的總蛋白，希望能找到與不同性別家蠶性狀差異相關(guān)的蛋白，為家蠶育種和蠶業(yè)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.對抗性親本NB、感性親本306及F1代經(jīng)口接種病毒后，死亡率的分析顯示，F(xiàn)1代與NB抗性親本都沒有出現(xiàn)家蠶個體死亡，對病毒表現(xiàn)出同樣的抵抗能力，而感性親本306全

4、部感染病毒死亡。表明家蠶抗病毒性狀的遺傳方式是顯性遺傳。
　　 2.將各品系家蠶中腸的總蛋白提取出來后，用二維電泳分離總蛋白白并比較各品系家蠶的蛋白表達譜。發(fā)現(xiàn)在正交組(NB♀，306♂，NB×306)中，有七個蛋白只在抗性品系中表達，包括pc21g12150，proteino-fucosyltransferase2，protein LST8 homolog，caspase-1，hemolymphprotein，serine p

5、rotease，glucose phosphate dehydrogenase。有三個蛋白只在感性品系中表達，包括heat shock protein90，phosphodiesterasesubunit alpha和adenosine kinase。在反交組(306♀，NB♂，306×NB)中，有六個蛋白只在抗性品系中表達，包括caspase-1，carboxylesterase，serine protease，hypothetica

6、l protein，antennal binding protein，還有一個未成功鑒定的蛋白。有兩個蛋白只在感性品系中表達，包括argininekinase和wall-associated receptor kinase-like4。將正交組和反交組的結(jié)果結(jié)合起來看，發(fā)現(xiàn)有兩個蛋白：半胱天冬酶-1(caspase-1)和絲氨酸蛋白酶(serine protease)無論在正交組還是反交組中，都只在抗性品系中表達，在感性品系中不表達。<

7、br>　　 3.將正交組和反交組中所有的抗性或感性品系特異表達蛋白做基因聚類分析和KEGG pathway分析，然后統(tǒng)計這些差異蛋白主要參與的生物途徑和分子功能。對各個差異蛋白的功能進行分析，發(fā)現(xiàn)半胱天冬酶-1、絲氨酸蛋白酶和羧酸酯酶有可能參與家蠶的抗病毒過程，而熱休克蛋白90可能是導(dǎo)致家蠶對NPV病毒敏感的因素。
　　 4.半胱天冬酶-1、絲氨酸蛋白酶在抗性親本NB、F1代(正交組和反交組)中都檢測到表達，而在感性親本306

8、中檢測不到表達，表明它們可能在家蠶的抗病毒過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，用Western blot對它們在抗性和感性品系中的差異表達進行驗證。實驗結(jié)果再次顯示這兩個蛋白只有抗性品系中能檢測到表達，在感性品系中檢測不到，與二維電泳結(jié)果一致。
　　 5.在五齡第二天，將NB家蠶分成不同的性別組，提取中腸組織，用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較不同性別家蠶蛋白質(zhì)表達譜的差異。發(fā)現(xiàn)有5個蛋白只在雄蠶中表達，包括predicted protein，musc

9、le glycogenphosphorylase，isocitrate dehydrogenase，uridine5’-monophosphatesynthase，vacuolar ATPase B subunit。5個蛋白只在雌蠶中表達，包括vacuolar ATP synthase catalytic subunit A，coA-substrate-specific enzymeactivase，ef1 alpha-like fac

10、tor isoform1，hypothetical protein，還有一個未成功鑒定的蛋白。8個蛋白在雄蠶中的表達量更高，包括conecGMP-specific3’，5’-cyclic phosphodiesterase subunit alpha’，vacuolar ATPsynthase subunit B，thiol peroxiredoxin，H+ transporting ATP synthasesubunit d，pred

11、icted protein，actin-depolymerizing factor1，mRNAtransport regulator3，還有一個未成功鑒定的蛋白。25個蛋白在雌蠶中的表達量更高，包括heat shock protein90，wall.associated receptorkinase-like4等。將鑒定到的差異蛋白做基因聚類和KEGG pathway分析，統(tǒng)計了雄蠶表達水平高和雌蠶表達水平高的蛋白主要參與的生物途徑和分

12、子功能，分析這些途徑和功能與不同性別家蠶性狀差異的關(guān)系。從差異蛋白中選取六個重要的蛋白，包括5’-尿苷酸合成酶，巰基過氧化還原酶，H+ATP合成酶D亞基，mRNA轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子3，絲氨酸蛋白酶抑制劑-2，磷酸甘油酸變位酶，用熒光定量PCR驗證這六個蛋白在不同性別家蠶章的差異表達。實驗結(jié)果與蛋白質(zhì)組實驗結(jié)果一致，即5’-尿苷酸合成酶只在雄蠶中檢測到表達，巰基過氧化還原酶，H+ATP合成酶D亞基和mRNA轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子3在雄蠶中的表達量比雌蠶中