家蠶品系871與871C抗家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的差異及機制研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是具有重要經(jīng)濟價值的馴化昆蟲，同時也是鱗翅目模式昆蟲，家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是對蠶業(yè)危害最為嚴重的家蠶病原微生物之一，由BmNPV引起的家蠶血液型膿病常對蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。該病傳染性強、難以控制，雖然傳統(tǒng)的消毒方法能夠在一定程度上預(yù)防該病的發(fā)生，但仍具有很大局限性。因此，對BmNPV的侵染機制、家蠶對BmNPV抗性機制和培

2、育抗性家蠶素材的研究成為當(dāng)前蠶學(xué)領(lǐng)域最為緊迫的課題。雖然BmNPV與宿主相互作用研究已取得了不少成果，許多參與家蠶與病毒互作和具有抗病毒功能的基因已被發(fā)現(xiàn)和鑒定，但是，對于BmNPV侵染家蠶過程的分子機制仍不十分清楚，在BmNPV感染家蠶的過程中有哪些宿主基因或通路參與？BmNPV如何通過調(diào)控宿主細胞以利于自身復(fù)制增殖？這一系列的問題都亟待進一步研究。本研究檢測并鑒定了兩種抗性差異家蠶品系871與871C對BmNPV的抗性差異和組織感染

3、差異；分析了BmNPV在不同品系間的入侵和感染過程，并確定了BmNPV在抗性品系中被阻斷的時期；進一步通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析了871與871C抗性差異品系間的差異表達基因，并成功篩選得到一個具有顯著抑制BmNPV復(fù)制增殖能力的差異候選基因。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1.871與871C對BmNPV抗性的鑒定
　　通過定量添食家蠶核型多角體病毒后家蠶死亡統(tǒng)計檢測，871對BmNPV的半致死劑量（LD50）為3.8×103多角

4、體/頭，871C的半致死劑量為2.5×107多角體/頭，871C較871對BmNPV感染呈明顯抗性。通過添食病毒后（2×106多角體/頭）家蠶存活曲線分析表明，871死亡高峰在第5天，871C死亡高峰在第8天，表明871C感染BmNPV后具有顯著的死亡延后現(xiàn)象。皮下注射（2×104 BV/頭）存活曲線分析表明，871在感染第8天幾乎全部死亡（99%），而871C少量死亡（8%）。病征觀察結(jié)果顯示，871感染病毒后第3天出現(xiàn)體型變小、體重

5、減輕現(xiàn)象，隨后出現(xiàn)體形腫脹，體色乳白，狂躁爬行，皮破流膿的典型血液型膿病特征，然而在871C在感染BmNPV后在第5天與對照組出現(xiàn)差異，但未出現(xiàn)明顯病癥。通過解剖觀察，發(fā)現(xiàn)871病蠶體內(nèi)充滿病毒多角體，脂肪體消融，中腸易破等現(xiàn)象；血細胞連續(xù)觀察和統(tǒng)計結(jié)果分析顯示，在感染后48h，敏感品系871血細胞中即出現(xiàn)病毒多角體，并隨時間推移多角體逐漸增多，感染后96h，血細胞內(nèi)充滿病毒多角體，且血液中存在較多游離病毒多角體。871C至感染后96h

6、觀察到少量病毒多角體的產(chǎn)生。組織切片觀察顯示871中腸在感染后24h出現(xiàn)細胞核膨大的病變現(xiàn)象，隨后病變程度增加，到感染后96 h出現(xiàn)細胞核脫落現(xiàn)象。871C在感染BmNPV后，至96h未觀察到明顯變化。基于上述實驗分析，確定了871C與871對BmNPV的抗性差異。同時也確定后續(xù)實驗經(jīng)口感染劑量為2×106多角體/頭，注射實驗劑量為2×104BV/頭。
　　2. BmNPV感染871與871C的過程及組織差異
　　通過收集不

7、同時間點兩種家蠶品系的各個組織，通過qRT-PCR連續(xù)檢測病毒基因表達水平，鑒定經(jīng)口添食BmNPV在871與871C的感染過程。結(jié)果表明，871C經(jīng)口感染后6h，在家蠶中腸檢測到病毒；12h在血細胞和脂肪體檢測到病毒；24h頭部和氣管檢測到病毒；48h，表皮組織中檢測到病毒；72h檢測到病毒感染絲腺及生殖腺。這些結(jié)果表明，BmNPV初始感染家蠶中腸，隨后進入血液與脂肪體進行二次感染，進而感染家蠶頭部、表皮和氣管細胞，最后BmNPV感染家

8、蠶絲腺與生殖腺?？剐云废?71C與敏感品系871在BmNPV的感染過程中沒有差異。利用qRT-PCR檢測BmNPV在871與871C不同組織中病毒晚期基因vp39的表達水平，結(jié)果顯示：同一品系的不同組織比較發(fā)現(xiàn)，家蠶血液和脂肪體感染程度最高，其次是中腸、頭部、表皮和氣管，絲腺和生殖腺的感染程度最低。不同品系間相同組織比較結(jié)果顯示，871中vp39表達水平較871C均在2倍以上，表明BmNPV對871C與871的各個組織感染程度存在顯出差

9、異。通過帶有EGFP熒光標簽的示蹤病毒觀察病毒組織感染情況，結(jié)果進一步證實了組織感染的差異性。
　　3.BmNPV侵染關(guān)鍵組織的差異分析
　　桿狀病毒感染宿主昆蟲，存在初始感染和系統(tǒng)性感染兩個階段。在BmNPV感染家蠶過程中，病毒初始感染進入中腸和在中腸中的復(fù)制對其系統(tǒng)性感染至關(guān)重要。通過經(jīng)口添食和皮下注射，對BmNPV感染過程中中腸和血淋巴的感染情況進行了檢測。分析發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過熒光增白劑（FB280.05%）處理后，871與

10、871C感染BmNPV相比與未經(jīng)處理的對照組死亡時間提前1～2天，死亡率顯著增加，表明家蠶圍食膜對BmNPV的感染具有重要的防御作用；但兩個品系對BmNPV的敏感性變化未出現(xiàn)差異，表明圍食膜的屏障作用并不是影響兩者抗性差異的主要因素。BmNPV經(jīng)口感染后6h，對中腸中病毒DNA拷貝數(shù)和vp39表達水平檢測分析發(fā)現(xiàn)，兩者無顯著差異，表明BmNPV在入侵871與871C中腸細胞過程中兩者沒有差異。通過檢測BV粒子與兩種家蠶血清溫育后病毒毒力

11、的變化，發(fā)現(xiàn)871與871C的血清對病毒毒力沒有顯著影響。皮下注射感染24h后，均能夠在血細胞中觀察到綠色熒光，表明BV粒子均能夠進入871與871C的血淋巴細胞。通過對注射感染后血細胞中病毒DNA拷貝數(shù)與病毒vp39表達水平的檢測，在感染3h病毒DNA拷貝數(shù)與vp39表達量基本一致，表明病毒粒子進入血細胞沒有差異。綜合871與871C中腸細胞和血細胞中BmNPV的DNA復(fù)制水平和基因表達水平分析結(jié)果，表明BmNPV在感染過程中均能夠入

12、侵兩者細胞內(nèi)，但隨后BmNPV在受感染的細胞中的增殖出現(xiàn)了差異，暗示著抗性品系871C存在胞內(nèi)抑制病毒的復(fù)制和增殖機制。
　　4.BmNPV增殖被阻斷時期的分析
　　通過收集皮下注射后的兩種家蠶品系的血細胞在BmNPV感染后3h、6h、12h、24h和48h的RNA，反轉(zhuǎn)錄分別獲得cDNA文庫，基于BmNPV的立即早期基因ie-1、早期基因gp64、晚期基因vp39和lef-3、以及極晚期基因p10表達時序性，通過qRT-P

13、CR分析BmNPV在宿主細胞內(nèi)的基因表達過程。結(jié)果表明，兩種家蠶中感染后3h和6h及以內(nèi)ie-1，gp64，vp39均能夠低量表達，且兩者沒有明顯差異。說明病毒在感染初期并沒有受到抗性機制的影響；在感染12h及以后這些基因在兩種差異品系中表達水平出現(xiàn)顯著差異，且隨后在871C中下調(diào)表達。同時檢測了ie-1、vp39和p10在兩種家蠶品系脂肪體和中腸表達情況，結(jié)果與血細胞中的一致。以上結(jié)果顯示BmNPV在感染早期被抑制，表明871C存在某

14、種抗病毒機制抑制了病毒部分早期基因的表達，從而導(dǎo)致了病毒的復(fù)制增殖被阻斷。
　　5.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析兩品系的差異基因
　　為了進一步解析該差異機制，選取兩品系未感染及感染后12h、24h、48h的家蠶中腸，構(gòu)建8個轉(zhuǎn)錄組文庫進行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，得到1031差異表達基因。其中BmNPV感染分別引起敏感品系871和抗性品系871C中749個和381個基因發(fā)生顯著變化。GO分析分析這些差異基因主要集中在代謝、催化活性、細胞進程、結(jié)合

15、、細胞組分等，KEGG分析顯示，這些差異基因主要參與能量代謝、氨基酸的代謝、糖類代謝、次級產(chǎn)物代謝等。同時我們觀察到BmNPV對871的影響大于871C，暗示了BmNPV可能劫持了宿主細胞基本代謝通路用于自身復(fù)制增殖。不同品系間差異基因共有773個，抗性家蠶品系871C在模式識別、免疫通路、細胞凋亡、效應(yīng)分子等多種抗病毒通路基因表達均高于敏感品系871。通過對差異基因分析，發(fā)現(xiàn)差異基因BGIBMGA003660基因不僅在871C中高表達

16、，其表達水平是871的5.25倍，同時在BmNPV感染家蠶后該基因也上調(diào)表達，且該基因與其他昆蟲C-type Lectin（具有抗感染等免疫功能）具有很高的同源性，暗示該基因可能具有抑制BmNPV增殖的作用，因此我們將BGIBMGA003660基因作為候選基因進行深入研究。
　　6.BmCTL-S5基因的克隆表達及抗病毒功能分析
　　為了鑒定候選基因（BGIBMGA003660）在BmNPV復(fù)制增殖中的功能特征，本研究成功克

17、隆了BGIBMGA003660（BmCLT-S5）基因并對該基因進行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白包含一個EPQ（Glu-Pro-Gln）保守基序和CRD保守結(jié)構(gòu)域，其N-端含有21aa的信號肽。對該蛋白進行亞細胞定位分析結(jié)果表明，BmCLT-S5蛋白均勻的分布于細胞質(zhì)中。RT-PCR分析顯示BmCLT-S5在抗性品系（871C）中表達顯著高于敏感品系（871），BmNPV感染后該基因上調(diào)表達，且871C表達水平顯著高于871。過表達

18、piZBmCTL-S5Flag結(jié)果顯示過表達的細胞中沒有檢測病毒的熒光信號，能夠明顯抑制BmNPV增殖復(fù)制；進而篩選該基因過表達的穩(wěn)定細胞系感染BmNPV后，發(fā)現(xiàn)該基因能夠在基因表達水平，DNA復(fù)制水平和病毒增殖水平有效抑制病毒增殖。瞬時轉(zhuǎn)染BmCLT-S5的Cas-9敲除載體Cas9-CTL，結(jié)果表明敲除載體能夠顯著編輯BmCLT-S5基因，敲除該基因能夠明顯促進病毒復(fù)制增殖。以上結(jié)果表明BmCLT-S5具有顯著抑制BmNPV復(fù)制增殖