家蠶核型多角體病毒編碼miRNAs的功能分析.pdf

1、蠶業(yè)是我們國(guó)家重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，家蠶又是鱗翅目昆蟲(chóng)進(jìn)行遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式昆蟲(chóng)。家蠶核型多角體病毒(BmNPV)是蠶業(yè)生產(chǎn)中比較常見(jiàn)的病毒，家蠶感染后會(huì)導(dǎo)致非常高的致死率，給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失，培育對(duì)核型多角體病毒具有抗性的家蠶品種可以減小損失，然而至今該病毒還是蠶業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)痼疾。miRNAs是由長(zhǎng)度大約22-23個(gè)核苷酸組成，屬于內(nèi)源性的非編碼RNA，由70個(gè)堿基左右的miRNAs前體加工而成。miRNAs通過(guò)RNA誘

2、導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）作用于靶基因的mRNAs的3' UTR序列，越來(lái)越多的證據(jù)表明在病毒感染宿主過(guò)程中，miRNAs在病毒與宿主相互作用中起到了重要的調(diào)控作用。本文通過(guò)高通量測(cè)序從感染核型多角體病毒的家蠶血淋巴中發(fā)現(xiàn)了14條病毒編碼的miRNAs，并用實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證了其中的7條，并對(duì)其中2條做了的靶基因的預(yù)測(cè)和調(diào)控功能的研究。主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Ω腥炯倚Q核型多角體病毒的家蠶血淋巴中的miRNAs進(jìn)行分析

3、，發(fā)現(xiàn)了14條病毒編碼的miRNAs，通過(guò)頸環(huán)PCR驗(yàn)證了其中的7條，并遞交到了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)其中表達(dá)豐度最高的2條（BmNPV-miR-364和BmNPV-miR-415），做了進(jìn)一步研究分析。通過(guò)線(xiàn)軟件RNA22和RNA hybrid對(duì)BmNPV-miR-364、BmNPV-miR-415與家蠶和病毒基因的3' UTR進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BmNPV-miR-364的靶基因6個(gè)，BmNPV-miR-415的靶基因9個(gè)。
　　2.

4、分別構(gòu)建BmNPV-miR-364前體、BmNPV-miR-415前體和15個(gè)靶基因的重組表達(dá)載體。將miRNAs與對(duì)應(yīng)靶基因的3' UTR共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)（DLR）分析發(fā)現(xiàn)得到BmNPV-miR-415特定靶向家蠶基因Prx5037、attA和病毒靶基因GTA，BmNPV-miR-364特定靶向病毒基因DNA polymerase。分別用miRNAmimic和miRNA inhibitor對(duì)內(nèi)源性BmNPV

5、-miR-364與BmNPV-miR-415進(jìn)行了功能獲得性和功能缺失性分析，發(fā)現(xiàn)BmNPV-miR-364與BmNPV-miR-415都能抑制各自靶基因的表達(dá)。
　　3.將BmNPV-miR-415轉(zhuǎn)染進(jìn)家蠶BmN細(xì)胞，用雙向電泳技術(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染BmNPV-miR-415后的細(xì)胞比未轉(zhuǎn)染的多一個(gè)蛋白差異點(diǎn)。對(duì)該蛋白差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)該蛋白并不是之前通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)得到的靶基因中的一個(gè)，而是雷帕霉素的靶標(biāo)基因2（TO

6、R2），推測(cè)BmNPV-miR-415的靶基因編碼的蛋白可能是表達(dá)量過(guò)低或者被高豐度蛋白所掩蓋。
　　4.對(duì)BmNPV-miR-415與TOR2基因的序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BmNPV-miR-415并沒(méi)有靶向TOR2基因。用TOR2基因的3' UTR與高通量測(cè)序得到的家蠶的miRNAs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)TOR2基因的3' UTR有特異性靶向；構(gòu)建bmn-miR-5738與TOR2基因的3' UTR的表達(dá)載體，與BmNPV-miR-415

7、分別轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BmNPV-miR-415與bmn-miR-5738均能上調(diào)TOR2基因的表達(dá)；通過(guò)qPCR分析感染核型多角體病毒的家蠶血淋巴中bmn-miR-5738與TOR2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，感染前24 h bmn-miR-5738、TOR2與BmNPV-miR-415的表達(dá)趨勢(shì)一致，24 h后BmNPV-miR-415的表達(dá)水平一直升高，而bmn-miR-5738與TOR2的表達(dá)下調(diào)；對(duì)五齡起蠶第1天的