蛋白質(zhì)組學(xué)篩選肝癌差異蛋白及其與腫瘤分子成像特征的相關(guān)研究.pdf

1、目的：本研究擬應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，建立人分辨率高和重復(fù)性好的肝癌組織(門靜脈轉(zhuǎn)移組/門靜脈非轉(zhuǎn)移組)及正常肝組織的二維電泳圖譜，篩選并鑒定癌組織與正常肝組織以及門靜脈轉(zhuǎn)移的肝癌組織和門靜脈無轉(zhuǎn)移的肝癌組織間差異表達(dá)蛋白并進(jìn)行表達(dá)水平驗(yàn)證，并將轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤分子成像特征進(jìn)行相關(guān)性研究。為最終發(fā)現(xiàn)肝癌診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)提供重要信息。 方法：收集術(shù)后新鮮肝癌標(biāo)本和距癌旁1.5cm以上正常肝組織保存于-80℃?zhèn)?/p>

2、用。根據(jù)病理診斷結(jié)果將標(biāo)本分為3組：門靜脈轉(zhuǎn)移的肝癌組(肝癌轉(zhuǎn)移組)、門靜脈未受侵犯的肝癌組(肝癌非轉(zhuǎn)移組)、正常肝組織組(正常組)，每組各5例。提取組織總蛋白，采用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)得到各組凝膠圖譜。采用PD-quest 7.3軟件進(jìn)行合成、對(duì)比和差異分析，識(shí)別肝癌轉(zhuǎn)移組、肝癌非轉(zhuǎn)移組、正常組之間差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)；選取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，膠內(nèi)酶解后行肽指紋圖分析及網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫鑒定，鑒定差異蛋白質(zhì)。然后采用免疫印跡(Western B

3、lot)驗(yàn)證部分差異表達(dá)蛋白(annexin A3、 laminB1、HSP27、nm23-H1、Prohibitin、Triosephosphate isomerase(EC5.3.1.1)(TIM))的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步在臨床標(biāo)本中檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與腫瘤分子影像特征的相關(guān)性。 結(jié)果：建立了正常肝組織和肝癌雙相凝膠電泳圖譜，多數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)集中在pH4～8、分子量20～100KDa范圍。選擇

4、在肝癌轉(zhuǎn)移組和肝癌非轉(zhuǎn)移組中表達(dá)均高于正常組的13個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，并鑒定出在肝癌轉(zhuǎn)移組中表達(dá)高于肝癌非轉(zhuǎn)移組中表達(dá)的7種蛋白質(zhì)為annexin A3、1aminB1、annexin A1、transgelin-2、TCP1、PRP2、RANBP Protein。 Western Blot檢測(cè)肝癌和配對(duì)正常肝組織中annexin A3、1amiaB1、HSP27的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肝癌中3種蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均高于正常肝組織中的表達(dá)；而抑癌

5、基因表達(dá)蛋白nm23-H1、Prohibitin、Triosephosphate isomerase(EC 5.3.1.1)(TIM)在肝癌組織中表達(dá)降低。 在以上對(duì)篩選蛋白進(jìn)行初步驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)annexin A3和nm23-H1在組織樣本中的表達(dá)情況，探討annexin A3和nm23-H1表達(dá)水平的病理意義，annexin A3在正常肝組織組(正常組)、肝癌門靜脈未受侵犯組(非轉(zhuǎn)移組)、肝癌伴門靜脈

6、轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移組)中的表達(dá)陽性率分別為10％，35％，92.5％，方差分析提示多組間比較具有顯著性差異(x 2=57.667，P<0.001)。進(jìn)一步進(jìn)行兩組間的比較發(fā)現(xiàn)：annexin A3陽性表達(dá)率在正常組分別與非轉(zhuǎn)移組、轉(zhuǎn)移組，非轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組組間均有顯著性差異。nm23-H1在正常組、非轉(zhuǎn)移組、轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)陽性率分別為85％，82.5％，15％，方差分析提示多組間比較具有顯著性差異(x 2=52.95，P<0.001)。進(jìn)一步進(jìn)行

7、兩組間的比較發(fā)現(xiàn)：正常組和非轉(zhuǎn)移組間的nM23-H1陽性表達(dá)率無顯著性差異(x2=0.092，P=0.762)。正常組與轉(zhuǎn)移組間，非轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組間的nm23-H1陽性表達(dá)率均有顯著性差異(P<0.001)。 進(jìn)一步探討annexin A3和nm23-H1表達(dá)水平與腫瘤分子成像特征的相關(guān)性。PET-CT顯示門靜脈主干及分支出現(xiàn)充盈缺損組與非充盈缺損組間annexin A3及nm23-H1均有顯著性差異(P<0.001)，而腫瘤大

8、小、形態(tài)、糖代謝SUV組間annexin A3及nm23-H1均無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較人肝正常組織、肝癌門靜脈未受侵犯組、肝癌伴門靜脈轉(zhuǎn)移間的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)正常組織和肝癌組織間，以及門靜脈轉(zhuǎn)移和門靜脈非轉(zhuǎn)移組間均存在蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，對(duì)部分差異蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析，鑒定了可能參與肝癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)蛋白。通過免疫印跡方法驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)果一致。 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)