褐飛虱遺傳多樣性及其海藻糖合成酶基因功能的分析.pdf

1、褐飛虱(Nilaparvata lugens)是我國(guó)和許多亞洲國(guó)家當(dāng)前水稻上的首要害蟲，自20世紀(jì)70年代以來時(shí)有暴發(fā)，嚴(yán)重影響稻谷產(chǎn)量。褐飛虱有遠(yuǎn)距離遷飛的特性，每年3-4月份，褐飛虱開始從境外遷入我國(guó)。因此，褐飛虱的遷飛特性是造成其在我國(guó)暴發(fā)的根本原因。本課題以褐飛虱的遷飛為主線，從兩個(gè)方面開展相關(guān)研究，包括(1)利用高通量Solexa測(cè)序技術(shù)，對(duì)5個(gè)地理種群，包括越南河靜、菲律賓內(nèi)湖、廣東珠海、安徽潛山、云南思茅的褐飛虱基因組上＜

2、5％的序列進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其共有的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotidepolymorphism,SNPs)的存在方式和頻率進(jìn)行分析，構(gòu)建褐飛虱種群內(nèi)和種群間的遺傳分化關(guān)系，探討此方法在研究季節(jié)性長(zhǎng)距離遷飛昆蟲褐飛虱的遷飛過程的可行性；(2)利用飼喂法RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)研究褐飛虱飛行能量相關(guān)基因海藻糖合成酶(Trehalose phosphate synthase，TPS)的功能。論文

3、取得的主要結(jié)果如下：
　　 1.建立了對(duì)基因組序列未知昆蟲的經(jīng)濟(jì)有效的高質(zhì)量單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的獲得方法。對(duì)5個(gè)褐飛虱種群全基因組序列進(jìn)行測(cè)序的費(fèi)用是極其昂貴的，本研究建立了選取基因組上＜5％的基因組序列進(jìn)行測(cè)定的方法，每個(gè)種群只測(cè)定1G的數(shù)據(jù)量。測(cè)序質(zhì)量的評(píng)估表明該方法準(zhǔn)確性高，能獲得高通量的SNPs位點(diǎn)信息。
　　 2.構(gòu)建了褐飛虱種群內(nèi)和種群間的遺傳分化關(guān)系。
　　 1)將5個(gè)地理種群中滿足覆蓋度大于等于5

4、0倍覆蓋度及至少一個(gè)種群的SNP的頻率(minor allele frequency,MAF)＞0.05或MAF≠0的SNPs位點(diǎn)做兩兩種群間的歐式距離分析，結(jié)果顯示，在大于等于50倍覆蓋度時(shí)，廣東珠海、安徽潛山、及云南思茅這三個(gè)地理種群的相對(duì)距離最近，菲律賓與其它四個(gè)種群間的相對(duì)距離最遠(yuǎn)。
　　 2)聚類分析的結(jié)果表明，安徽潛山種群與廣東珠海種群在MAF＞0.05條件選擇與否的情況下都聚為最近的一支，越南河靜種群與云南思茅種群

5、最靠近，表明這兩個(gè)種群關(guān)系最近；而菲律賓內(nèi)湖種群處于聚類的最外端，與其它四個(gè)地理種群的差異最大，比越南種群與其它三個(gè)國(guó)內(nèi)的地理種群更遠(yuǎn)。
　　 3)在5個(gè)種群中，種群間的遺傳分化系數(shù)(coefficient of gene differentiation,Fst)的值在0.0046-0.0088之間，即絕大部分變異存在于各種群內(nèi)，說明種群間遺傳分化程度非常低。Fst的結(jié)果與5個(gè)地理種群歐式距離的結(jié)果和趨勢(shì)一致，即菲律賓內(nèi)湖種群與

6、其它四個(gè)地理種群的Fst值都是最大的，由Fst間接換算的基因流Nm在5個(gè)地理種群之間達(dá)到了28-54之間，遠(yuǎn)大于1，說明5個(gè)種群間的基因流較大。
　　 3.利用飼喂法RNAi技術(shù)，發(fā)現(xiàn)海藻糖合成酶對(duì)褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。RNAi目前已經(jīng)被廣泛地用來研究昆蟲基因的功能，其靶標(biāo)的特異性及高效性也使其成為控制害蟲的新方法。在本研究中，首先從褐飛虱中成功克隆到了海藻糖合成酶基因，該基因全長(zhǎng)3235bp，編碼一個(gè)807個(gè)氨基酸的蛋白

7、。該基因主要在脂肪體中表達(dá)，在中腸和卵巢也有微量表達(dá)。定量PCR的結(jié)果顯示TPS基因在褐飛虱若蟲至成蟲階段都有恒定且持續(xù)的表達(dá)。通過對(duì)褐飛虱持續(xù)飼喂NlTPSdsRNA的方式，發(fā)現(xiàn)在對(duì)3齡褐飛虱若蟲飼喂0.5μg/μl dsRNA(終濃度)2天后其靶標(biāo)基因的表達(dá)即有了明顯的下降，在取食4天、7天及10天時(shí)NlTPS的表達(dá)依然被抑制，并且海藻糖合成酶的酶活在飼喂NlTPS dsRNA2天后也出現(xiàn)了下降，到第7天時(shí)，其酶活下降到初始酶活的一