海藻糖合成酶基因克隆及其轉(zhuǎn)化草莓的研究.pdf

1、海藻糖是由兩個葡萄糖分子以α、α1→1糖苷鍵結(jié)合的非還原性雙糖,對許多生物的抗逆耐受性起著重要作用.酵母細(xì)胞中的海藻糖由TPS1、TPS2、TPS3和TSL1四個基因負(fù)責(zé)合成,其編碼的多肽組成一個海藻糖合酶復(fù)合體.TPS1基因編碼UDP-葡萄糖依賴性的海藻糖-6-磷酸合酶,TPS2基因編碼海藻糖-6-磷酸酯酶,TPS3和TSL1兩個基因的產(chǎn)物可能對復(fù)合體起穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用.實(shí)驗(yàn)證實(shí)TPS1基因就可以使生物體獲得產(chǎn)生海藻糖的能力,酵母的海藻

2、糖合成酶復(fù)合體中6-磷酸-海藻糖的脫磷酸化作用是非特異性的,它可由生物體內(nèi)的其它酯酶所代替.提取釀酒酵母的總DNA,以此為模板,采用PCR的方法從釀酒酵母中克隆出了1.488kb的海藻糖合成酶基因TPS1片段,通過XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切,與同樣經(jīng)過XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切的pUC118載體質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中,通過藍(lán)白斑篩選重組子.經(jīng)過酶切和PCR鑒定表明TPS1基因克隆進(jìn)載體中.將克隆出的序列進(jìn)行了測序.通過同樣方法將該

3、片段連接到pBI121載體上,轉(zhuǎn)化海藻糖合成酶基因缺失的大腸桿菌(菌株號FF4169,FF4169:NIC4100otsA1∷Tn10,MC4100為otsaBA基因野生型菌株).生長曲線表明,帶有克隆片段的轉(zhuǎn)化株在0.5mol/L NaCl的高滲透壓培養(yǎng)基中生長良好,而作為對照的缺失株則幾乎不能生長.這表明克隆所得到的片段具有海藻糖合成酶活性.將帶有TPS1基因的pBI121載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中,構(gòu)建了雙元轉(zhuǎn)化載體,經(jīng)菌

4、落原位雜交鑒定,證明TPS1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中.采用葉盤法利用轉(zhuǎn)化了的農(nóng)桿菌對草毒進(jìn)行侵染,用無菌濾紙吸干葉片上多余菌液,在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)三天,共培養(yǎng)后的葉片在附加40mg/L Kan和200mg/L Cef的再生培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng),篩選出的不定芽在附加25mg/L Kan的草毒繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選培養(yǎng)并增殖,增殖后的草毒植株轉(zhuǎn)入附加25mg/L Kan的生根培養(yǎng)基上生根,提取生根后抗性植株的DNA,經(jīng)過PCR和點(diǎn)雜交鑒定,證實(shí)所獲得植