海藻糖合成酶基因轉(zhuǎn)化玉米.pdf

1、干旱是玉米生產(chǎn)的主要限制因素。通過品種改良提高玉米品種耐旱能力，是克服干旱危害最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。然而，玉米的耐旱性為微效多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳改良比較困難，多年來進(jìn)展不大。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破物種間生殖隔離，轉(zhuǎn)化利用其他物種有益基因。國內(nèi)外曾用SOD、DREB等多種抗逆耐旱基因轉(zhuǎn)化玉米，試圖提高其耐旱性，但因這些基因耐旱能力不夠強(qiáng)，耐旱機(jī)制與玉米生理代謝不協(xié)調(diào)等原因，轉(zhuǎn)基因后代的耐旱性不能達(dá)到玉米生產(chǎn)要求。探索利用耐旱能力更高，適宜

2、玉米生理代謝機(jī)制與生產(chǎn)要求的耐旱基因，是轉(zhuǎn)基因耐旱玉米培育的技術(shù)關(guān)鍵。利用海藻糖的抗逆耐旱特性，采用基因工程將其相關(guān)酶的基因轉(zhuǎn)入玉米等作物，進(jìn)而培育抗旱耐鹽新品種，這對于植物遺傳改良具有重要意義。 本研究按Adams介紹的方法提取啤酒酵母AS.1416菌株基因組DNA。依據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則，采用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增酵母基因組DNA上的TPS1片段。該引物在擴(kuò)增出的TPS1片段兩端引入新的酶切位點(diǎn)BamHⅠ

3、和ApaⅠ。瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增的TPS1片段并插入到T載體pMD19-TVector中，命名為pT-TPS1。 單子葉植物表達(dá)載體pC1300UbiDREB含有玉米泛素啟動(dòng)子ubiquitin、由植物組成型35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的選擇標(biāo)記基因Hyg和大腸桿菌選擇標(biāo)記基因Kan。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和ApaⅠ分別消化pC1300UbiDREB質(zhì)粒和包含TPS1基因的pT-TPS1質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳分別回收大片段和小片段，經(jīng)T4

4、-DNA連接酶連接后，組成單子葉植物表達(dá)載體pC1300UbiTPS1。 根據(jù)載體pC1300UbiTPS1多酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和ApaⅠ消化pC1300UbiTPS1，瓊脂糖凝膠電泳顯示長1603和11700bp的兩條特異帶，分別是TPS1和pC1300UbiTPS1質(zhì)粒骨架的長度。由此說明，TPS1基因插入到載體pC1300UbiTPS1中。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化“18.599R”和“18.599W”玉米

5、胚性愈傷組織，兩輪潮霉素梯度篩選后，得到“18.599R”和“18-599W”抗性愈傷組織各340和607塊。愈傷組織的轉(zhuǎn)化率分別為6.4％和10.2％，兩者之間沒有顯著性差異。但是，“18.599R”愈傷組織的再生能力明顯高于“18.599W”?？剐杂鷤M織分化培養(yǎng)分別得到再生植株54和31株。PCR檢測獲得1個(gè)陽性植株。 研究發(fā)現(xiàn)以繼代后7～9d的愈傷組織侵染，其抗性愈傷的獲得率最高。在共培養(yǎng)時(shí)添加400mg/L半胱氨酸有助

6、于獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化水平，半胱氨酸作為一種抗氧化抑制劑有助于T-DNA轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織中去。農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.5，侵染時(shí)間為10min時(shí)，殺菌比較容易，愈傷組織褐化率較低，是最適合的侵染濃度和時(shí)間。共培養(yǎng)時(shí)間以3d為最佳。 PCR檢測陽性的植株，還有待進(jìn)一步作分子雜交和表達(dá)檢測，以及后代的分子標(biāo)記選擇和耐旱性鑒定，培育成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。除探索轉(zhuǎn)化利用外源海藻糖合成酶基因，提高玉米耐旱性的可能性外，也有助于研究海藻糖