家蠶核型多角體病毒BmNPV orf59基因的功能研究.pdf

1、桿狀病毒（Baculovirus）是目前已知昆蟲病毒中類群最大且最有實(shí)用價(jià)值的病毒之一。桿狀病毒是一類專一性感染節(jié)肢動物病毒，在感染周期中有兩種表型不同但基因型完全一致的病毒形態(tài)，即出芽型病毒（Budded virus，BV）和包涵體衍生型病毒（Occlusion-derived virus，ODV），桿狀病毒基因組大小在80~180Kb之間。其中家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm

2、NPV)大部分基因的功能在之前已被研究報(bào)道，但還有一些基因的功能是未知的。本文以BmNPV orf59（Bm59）為研究對象，研究該基因?qū)mNPV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及組裝的影響。Bm59是家蠶核型多角體病毒的核心基因之一，但在病毒生活周期過程中的作用尚未可知。本實(shí)驗(yàn)利用λRed重組技術(shù)和Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建野生型重組病毒wtBacmid-polh-egfp、缺失型重組病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及補(bǔ)回型重

3、組病毒Bm59re-Bacmid-polh-egfp，并將3種重組病毒分別轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN。病毒滴度測定結(jié)果表明3種重組病毒都能產(chǎn)生有活力的子代病毒并使細(xì)胞感染發(fā)病，但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各個(gè)時(shí)相的滴度值顯著低于其他兩種重組病毒（P<0.05），表明Bm59的缺失不能使桿狀病毒徹底失去感染能力，但降低桿狀病毒的增殖水平和感染能力。電鏡分析結(jié)果發(fā)現(xiàn) Bm59ko-Bacmid-polh-egfp感染的細(xì)胞中只

4、有少量細(xì)長的桿狀結(jié)構(gòu)，而其他兩種重組病毒感染細(xì)胞后能夠產(chǎn)生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子，說明Bm59的缺失干擾病毒的增殖和包裝。Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bm59缺失型重組病毒基因組的復(fù)制能力顯著低于其他兩種重組病毒（P<0.05），qRT-PCR結(jié)果顯示Bm59缺失型重組病毒早期基因lef-3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于其他兩種重組病毒（P<0.05）。為研究 Bm59基因的表達(dá)時(shí)相，構(gòu)建了Bm59的原核表達(dá)