植物鎂離子螯合酶催化動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、鎂離子螯合酶是植物葉綠素生物合成途徑分支的第一個(gè)酶，在依賴ATP的條件下催化將Mg2+插入原卟啉Ⅸ形成鎂原卟啉Ⅸ。它至少由三個(gè)亞基組成，分別是I亞基(40-45 k Da)、D亞基(70-90 k Da)及H亞基(140-150 k Da)。它不但催化葉綠素的合成，參與葉綠體與細(xì)胞核的反向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且介導(dǎo)ABA信號(hào)途徑以及參與基因表達(dá)調(diào)控。雖然在光合紅細(xì)菌中對(duì)鎂離子螯合酶的研究取得了大量進(jìn)展，但在植物中的研究還知之甚少。因此研究高等植

2、物鎂離子螯合酶的催化動(dòng)力學(xué)及其作用機(jī)理，對(duì)闡明葉綠素代謝途徑的調(diào)控、葉綠體與細(xì)胞核反向信號(hào)及葉綠體ABA信號(hào)途徑具有重要意義。
　　 本研究主要以水稻鎂離子螯合酶為對(duì)象，建立了植物鎂離子螯合酶的體外研究系統(tǒng)，對(duì)其的所有亞基及底物進(jìn)行了系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)分析，揭示了植物鎂離子螯合酶催化的機(jī)制。本研究主要得到了以下結(jié)果：
　　 克隆、表達(dá)并純化了水稻鎂離子螯合酶的所有亞基及輔助蛋白GUN4，率先建立了植物鎂離子螯合酶的體外研究系統(tǒng)

3、。利用此系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)GUN4在體外極大地增強(qiáng)了鎂離子螯合酶的活性，提高反應(yīng)速率達(dá)16倍。這主要是通過(guò)幫助H亞基與原卟啉Ⅸ形成穩(wěn)定復(fù)合物來(lái)完成，并且這一過(guò)程需要鎂離子和ATP的參與。GUN4蛋白C末端的9或10個(gè)氨基酸對(duì)鎂離子螯合酶的激活作用至關(guān)重要，但缺失那些氨基酸并不影響與原卟啉Ⅸ的結(jié)合，并且這些氨基酸在高等植物中是保守的，而在藍(lán)細(xì)菌等中是不存在，說(shuō)明這也許是高等植物GUN4蛋白特有的調(diào)控方式。
　　 通過(guò)BN/SDS-PAGE、

4、凝膠過(guò)濾和免疫印跡結(jié)果顯示，D亞基在植物體內(nèi)主要以六聚體形式存在，而I亞基則為單體或緊密的二聚體，GUN4與H亞基在體內(nèi)形成了分子量為180 kDa的復(fù)合物。
　　 底物ATP和Proto的動(dòng)力學(xué)曲線為雙曲線，即符合米氏方程，而底物Mg2+則為S形曲線，符合希爾方程，對(duì)催化反應(yīng)有正協(xié)同效應(yīng)。I亞基和GUN4的動(dòng)力學(xué)分析顯示兩者符合米氏方程，而H亞基和GUN4的復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)則符合希爾方程，存在正協(xié)同效應(yīng)。并且希爾反應(yīng)系數(shù)為3，說(shuō)

5、明有多個(gè)H亞基和GUN4的復(fù)合物與D和I的復(fù)合物結(jié)合。并且GUN4與H及原卟啉Ⅸ復(fù)合物的形成，是整個(gè)催化反應(yīng)的限速步驟。
　　 活性重組實(shí)驗(yàn)表明，單雙子葉植物之間鎂離子螯合酶非常保守，各亞基相互交叉依然具有活性。而植物與光合細(xì)菌之間除D亞基重組之外其余則沒(méi)有活性。
　　 水稻中存在兩個(gè)I亞基，兩者結(jié)構(gòu)類似，但是I2亞基不但不能替換I1亞基的活性，并且還會(huì)破壞I1亞基與D亞基所形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而抑制鎂離子螯合酶的活性