交聯(lián)固定化磷脂酶D催化性能及動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、磷脂酶D催化磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)是合成高純度功能性磷脂產(chǎn)品的關(guān)鍵技術(shù)。通過(guò)固定化可以實(shí)現(xiàn)酶的回收利用，減少酶消耗，降低成本。因此可將磷脂酶D固定化后應(yīng)用于磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中。然而，固定化后由于載體的介入或酶自身空間構(gòu)象的改變，增大了反應(yīng)過(guò)程傳質(zhì)阻力的影響。同時(shí)，反應(yīng)過(guò)程還存在著水解與轉(zhuǎn)磷脂?；g的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的生成速率和收率帶來(lái)影響。因此，正確地評(píng)價(jià)固定化磷脂酶D的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)效果，掌握固定化磷脂酶D的催化反應(yīng)規(guī)律，優(yōu)化反應(yīng)條件，并

2、對(duì)其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究勢(shì)在必行。本文對(duì)本實(shí)驗(yàn)室自主制備的吸附-聚集-交聯(lián)固定化磷脂酶D(酶活力：6.37U/mg)和交聯(lián)磷脂酶D聚集體(酶活力：28.62U/mg)的催化反應(yīng)性能進(jìn)行研究，以催化磷脂酰膽堿(PC)轉(zhuǎn)磷脂?；a(chǎn)磷脂酰乙醇胺(PE)為評(píng)價(jià)模型，確定兩種固定化酶轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)的最優(yōu)條件，在此基礎(chǔ)上，對(duì)兩種固定化酶的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究比較。為后續(xù)固定化磷脂酶D的工業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)

3、對(duì)傳統(tǒng)吸附-交聯(lián)固定化方法的改進(jìn)，引入沉淀劑的作用，提出酶的吸附-聚集-交聯(lián)固定化法(Adsorbing-Aggregating-Cross-Linking method)。并采用此方法制備得到了酶活力高，穩(wěn)定性好的固定化磷脂酶D，本文首先對(duì)吸附-聚集-交聯(lián)固定化磷脂酶D的催化性能進(jìn)行研究，確定出此固定化酶用于轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)的最佳條件為：以乙醚為有機(jī)相，溫度30℃，pH=6；同時(shí)，對(duì)固定化磷脂酶D的基礎(chǔ)動(dòng)力學(xué)因素進(jìn)行考察，確定了實(shí)現(xiàn)最佳

4、反應(yīng)速率的底物PC濃度為1mM，乙醇胺(EA)濃度為50mM，固定化酶用量為0.5g，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。在此條件下，固定化酶的最佳反應(yīng)速率能夠達(dá)到8.37μmol/min·mg。同時(shí)，對(duì)反應(yīng)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行擬合和模擬，發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)的反應(yīng)條件和動(dòng)力學(xué)參數(shù)下，此固定化磷脂酶D催化磷脂酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)中伴隨的水解反應(yīng)基本可以忽略。這將為固定化磷脂酶D的應(yīng)用提供更加廣闊的平臺(tái)。
　　 另外，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室制備得到的無(wú)載體交聯(lián)磷脂酶D聚集

5、體的催化性能及動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。得到交聯(lián)磷脂酶D聚集體催化磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為：溫度32℃，pH=7，有機(jī)溶劑為乙醚，此條件下得到的基礎(chǔ)動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：底物PC濃度為1mM，EA濃度為50mM，固定化酶用量為0.2g，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。在此條件下，固定化酶的最佳反應(yīng)速率能夠達(dá)到38.42μmol/min·mg。同時(shí)，對(duì)反應(yīng)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行擬合和模擬，發(fā)現(xiàn)，此固定化酶催化轉(zhuǎn)磷脂酰基反應(yīng)中水解反應(yīng)的影響也很小，可見(jiàn)，磷脂酶

6、D固定化后，明顯提高了對(duì)底物的選擇特異性。
　　 對(duì)前兩章的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，固定化酶制備方法及原理不同，其催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也必然發(fā)生變化，因此通過(guò)對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的理論分析，在初步判定內(nèi)外擴(kuò)散對(duì)反應(yīng)影響的同時(shí)，分別測(cè)定AACL法和CLEA法固定化磷脂酶D催化磷脂酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)過(guò)程中，不同雙底物濃度下的反應(yīng)速率，求出動(dòng)力學(xué)模型中的平衡常數(shù)，并采用Matlab語(yǔ)言對(duì)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行模擬，模型能直觀(guān)地反映酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的過(guò)程，為后