動力性肺動脈高壓犬肺動脈pcna及α┐平滑肌肌動蛋白的表達

1、<p>　　動力性肺動脈高壓犬肺動脈PCNA及α┐平滑肌肌動蛋白的表達</p><p>　　作者：崔勤，楊景學，趙建斌，朱海龍 </p><p>　　【關鍵詞】 高血壓 </p><p>　　關鍵詞 :高血壓，肺性;疾病模型，動物;血液動力學;增殖細胞核抗原;肌動蛋白類 </p><p>　　摘 要:目的 探討平滑肌細胞

2、增殖在動力性肺動脈高壓形成中的作用. 方法 利用降主動脈―左下肺動脈分流建立的幼犬動力性肺動脈高壓模型，取90d肺組織病理切片，應用鼠抗人增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、α-平滑肌細胞肌動蛋白抗體（α-actin）、及Dako二抗免疫組化檢測，圖像分析儀對所得結果進行分析，然后計數(shù)高倍鏡下平滑肌細胞總數(shù)及PC-NA細胞陽性數(shù)，計算細胞增殖指數(shù). 結果 分流犬左下肺動脈中膜α-actin免疫組化染色呈強陽性表達，右下肺動脈弱陽性，而對

3、照組均呈陰性;分流犬左下肺動脈PCNA陽性信號表達明顯多于右肺動脈，而右肺動脈及左上肺動脈僅有少量表達;增殖指數(shù)左下肺動脈內膜為33%，中膜11%，外膜7%，右下肺動脈僅為少量. 結論 平滑肌細胞增殖參與實驗犬動力性肺動脈高壓形成過程并與肺動脈壓力增高程度和肺血管重構改變一致. </p><p>　　Keywords:hypertension，pulmonary;disease models，animal;h

4、emodynamics;proliferating cell nuclear antigen;actins </p><p>　　Abstract:AIM To explore the action of pulmonary artery smooth muscle cell proliferation in formation of dynamic pul-monary hypertension.METHO

5、DS Using the pulmonary hy-pertension（PH）model of shunt from descending aorta-to-left lower pulmonary artery，the sample of the lung tissue in shunt dogs was obtained on the90th day postoperation.The examination of PCNA an

6、dα-actin was done by immunohis-tochemistry method using PCAN andα-actin antibodies.The slices of pulmonary tissue were observed under high</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　肺動脈高壓往往伴隨肺動

7、脈結構改變，而肺動脈的病理改變又是肺動脈壓力持續(xù)上升的形態(tài)學基礎，其最基本的病理改變既是平滑肌細胞的增殖肥大.增殖細胞核抗原（PCNA），平滑肌肌動蛋白（α-actin）是反映細胞增殖狀態(tài)的重要生物學指標.我們利用免疫組化技術觀察平滑肌細胞增殖在肺動脈高壓發(fā)病過程中的作用. </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料

8、 </p><p>　　雜種幼犬，年齡2～3mo，體質量3.5～4.5kg，雌雄不拘，分兩組:組1為分流組（n=12），全部行左側開胸，降主動脈向左下肺動脈分流術，術后90d放血處死，取肺組織行病理學檢測.鼠抗人PCNA（1∶100）抗體，鼠抗人α-actin（1∶100）抗體和生物素化羊抗鼠（1∶200）抗體，均為博士德公司產品，微波修復液DAB顯色液，0.01mmol&#12539;L-1 PBS

9、液為本院病理科配制.圖像分析儀（Leica Q570c）為德國產品. </p><p>　　1.2 方法 </p><p>　　利用降主動脈―左下肺動脈分流建立的幼犬動力性肺動脈高壓模型［1］ ，取90d肺組織病理切片，用免疫S-P兩步法進行.石蠟切片脫蠟至水后0.01mol L-1 pH7.4PBS液洗滌5min×3次（下同），30mL&#12539;L-1 H

10、2 O 2 封閉30min，置于微波處理液中微波處理10min，冷卻，洗滌，加一抗4℃過夜，37℃水箱溫浴60min，生物素化二抗（羊抗鼠）37℃，30min，DAB5mg+H2 O 2 5mL顯色5～10min后水洗，蘇木素襯染30s，鹽酸酒精分化，氨水返藍，水洗，脫水、透明、常規(guī)封片鏡檢.每張切片隨機選取5個不同部位，計數(shù)每個高倍鏡下平滑肌細胞總數(shù)及PCNA細胞陽性數(shù)計算細胞增殖指數(shù).空白對照實驗:PBS替代第一抗體，替代對照實驗:

11、小牛血清替代第一抗體.統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)以百分數(shù)（%）表示，統(tǒng)計學處理用方差分析（χ2 ）處理. </p><p><b>　　2 結果 </b></p><p>　　2.1 PCNA免疫組化結果 </p><p>　　手術后90d可見分流犬左下肺動脈內膜細胞核內出現(xiàn)較多棕黃色染色，中膜較少，右肺動脈及左上肺動脈僅有少量表達，空白對照組

12、和替代對照組呈陰性表達（P&lt;0.01，Tab1）.表1 分流犬不同部位肺動脈細胞增殖指數(shù)（略） </p><p>　　2.2 α-actin免疫組化結果 </p><p>　　α-actin免疫組化染色顯示分流犬左下肺動脈中膜α-actin呈陽性表達，對照組陰性表達.手術后90d可見分流犬左下肺動脈平滑肌細胞胞質內出現(xiàn)較多棕黃色染色（P&lt;0.01），右肺

13、動脈及左上肺動脈僅有少量，空白對照組替代對照組呈陰性表達. </p><p>　　2.3 Ⅰ，Ⅲ型膠原纖維免疫組化結果 </p><p>　　分流后90d，分流犬肺動脈壁內Ⅰ、Ⅲ兩型膠原均有增多，左下肺動脈多于右下肺動脈，肺間質內也可見到膠原纖維的 </p><p><b>　　出現(xiàn). </b></p><p

14、><b>　　3 討論 </b></p><p>　　正常情況下肺動脈中各種纖維含量較少，平滑肌細胞處于“休眠期”［2］ ，α-actin表達陰性或弱陽性.當其受到一定刺激時，內皮細胞及激活的血小板細胞釋放有關因子如內皮依賴生長因子（EDGF）、血小板依賴生長因子（PDGF）及內皮素（ET）等，促進血管平滑肌迅速增殖，而且具有成纖維細胞樣功能產生膠原纖維和彈力纖維，用以適應改變的血管

15、張力［3］ .平滑肌肌動蛋白α-actin，作為平滑肌細胞的標記物，對于了解肺動脈平滑肌細胞增生情況有重大意義.PC-NA是一種核蛋白質、DNA聚合酶輔助因子［4］ .PC-NA的含量在細胞周期的G1 期開始增加，S期達高峰，G2 ，M期降低，G0 期測不到，其量的變化與DNA合成一致，靜止細胞PCNA表達極低，增殖活躍細胞PCNA表達明顯增加［5］ .Speir等［6］ 認為，引起細胞增殖的多種信號途徑匯聚在G1 /S期交界處并具有一

16、個引起DNA復制的共同機制，PCNA表達為細胞進入細胞周期進行DNA復制和分裂增殖所必需，應用反義PCNA寡核苷酸能有效抑制平滑肌細胞PC-NA表達和平滑肌細胞增殖.因此，PCNA是反映細胞增殖的另一重要生物學指標.Liu等［7</p><p>　　我們實驗中的分流犬左下肺動脈管壁內膜和中膜明顯增厚，PCNA陽性率增加，平滑肌細胞主要為合成表型，部分細胞呈退化跡象;膠原纖維豐富，分布較廣，在血管中、內、外膜均可見

17、到，其排列不整，α-actin在中、內膜均表達陽性，以中膜為主;PCNA表達主要在內膜為多，這與低氧所造成的肺動脈改變有著明顯的不同［10-13］ ，低氧所致的PCNA表達多位于外膜，而產生這一差異的機制尚不清楚，可能與肺動脈高壓形成原因不同有關.低氧性肺動脈高壓其成因在于低氧引起的肺血管痙攣，長期刺激造成多種細胞因子發(fā)生變化;動力性肺動脈高壓的產生的緣于來自體動脈的高壓血流，造成肺血管及其血管內的血液成分受到的切應力發(fā)生改變，一方面，

18、高壓血流直接作用于一直處于低壓狀態(tài)的肺血管，并在其中產生湍流，導致肺血管內皮損傷;另一方面，在高切應力作用下，引起血小板的快速釋放反應，血小板聚集，釋放促血管收縮物質.兩種原因同時起步，導致肺血管管壁增厚，管腔狹小或閉塞.管壁僵硬，血管阻力增加，導致肺動脈壓力進一步升高. </p><p>　　肺動脈高壓導致血管平滑肌SMC的大量增殖.是肺動脈高壓患兒出現(xiàn)肺血管改變的主要原因之一.從實驗犬不同部位肺血管PCNA

19、表達中我們可以看出，血管內不同壓力改變，對PCNA的表達產生重大影響.此結果與Jones等［14］ 應用免疫組化方法對持續(xù)性肺動脈高壓患者肺組織活檢結果相一致，即不同肺動脈壓力改變，產生不同肺血管改建，分流犬左下肺動脈主要接受分流來的高壓體動脈血，進而迅速產生肺動脈高壓并出現(xiàn)病理性改變，PCNA表達強陽性，而右下肺動脈主要接受來自右心室的低壓血流，盡管血流有所增多，但肺循環(huán)血流動力學改變不著，病理改變也不顯著，PCNA呈弱陽性表達.Ev

20、erett等［15］ 對年齡為42d的SD大鼠通過建立主動脈與腔靜脈間分流造成肺動脈血流增多，而肺動脈壓力并無明顯升高動物模型也出現(xiàn)相同結果. </p><p><b>　　參考文獻: </b></p><p>　?。?］Cui Q，Zhu HL，Yang JX，Liu XZ，Zhao JB.The establishment of the experiment

21、al partial pulmonary hypertension model in puppies ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（4）:328-330. </p><p>　?。?］Li J，Zhou AQ.The changes of pulmonary artery endothelial function and

22、costructure of congeital heart diseases with pul-monary hypertension［J］.Guowai Yixue Erkexue Fence（J For-eign Med Pediat），1994;21（6）:288-290. </p><p>　?。?］Cheng LZ.Histology［M］.2nd ed.Beijing:People’s Medic

23、al Publishing House，1993:841-843. </p><p>　?。?］Huang JX，Huang ZZ.The study advance of the proliferation cell nuclear antigen［J］.Guowai Yixue Shenglibinlikexue Yu Linchuang Fence（J Foreign Med Pathophysiol C

24、lin，1994;14（1）:9-11. </p><p>　?。?］Visakoupi T.Proliferative activity determined by DNA flow cy- tometry and proliferative cell nuclear antigen（PCNA）immuno-histochemistry as a prognostic in prostatic carcino

25、ma ［J］.J Pathol，1992;168（1）:7-14. </p><p>　?。?］Speir E，Epstein SE.Inhibition of smooth muscle cell prolifera-tion by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the mRNA encoding PCNA［J］.Circulation，1992;86

26、（2）:538-547. </p><p>　?。?］Liu j，Luo D，Wang P.Effects of hypoxia on the morphology and proliferation of cultured pulmonary arterial smooth muscle cell［J］.Chungkuo Yingyung Shengli Hsueh Tsa Chih（Chin J Appl

27、Physiol），1997;13（2）:110-113 </p><p>　　［8］Mitchill D，Botney，Michael J.Active collage synthesis by pul-monary arteries in human primary pulmonary hypertension［J］.Am J Pathol，1993;143（1）:121-129 </p>&

28、lt;p>　?。?］Botney MD，Liptay MJ，Kaiser LR，Cooper JD，Parks MC，Mecham RP.Active collage synthesis by pulmonary arteries in human primary pulmonary hypertension ［J］.Am J Pathol，1993;143（10）121-129. </p><p>　　

29、［10］Stenmark KP.Fasules J，Hyde DM，Voelel NF，Henson J，Tucker A，Wilson H，Reeves JT.Severe pulmonary hyperten-sion and arterial adventitial changes in newborn calves at4300m ［J］.J Appl Physiol，1987;62（8）:821-830. </p>

30、;<p>　?。?1］Tucker A，Migally N，Wright ML，Greenlees KJ.Pulmonary vascular changes in young and aging rats exposed to5486malti-tude［J］.Respiration，1984;46（3）:246-257. </p><p>　　［12］Wohrley JD，F(xiàn)rid MG，Mo

31、iseeva EP，Orton EC，Belknap JK，Stenmark KR.Hypoxia selectively induces proliferation in a spe-cific subpopulation of smooth muscle cells in the bovine neonatal pulmonary arterial media［J］.J Clin Invest，1995;96（1）:273-281

32、 </p><p>　?。?3］Xu ZL，Wu KJ，Yan YZ.The distributive changes of hypotonic anoxic pulmonary artery collagen［J］.Zhongguo Yixue Kex-ueyuan Xuebao（J Med Sci Acad China），1995;17（3）:167-170. </p><p>　　

33、［14］Jones PL，Cowan KN，Rabinovitch M.Tenascin-C，prolifera-tion and subendothelial fibronectin in progressive pulmonary vascular disease［J］.Am J Pathol，1997;150（4）:1349-1360. </p><p>　　［15］Everett AD，Le Cras