基于泥蚶血紅蛋白和microRNA應(yīng)答鎘脅迫機制初探.pdf

1、鎘(Cd)已成為海洋水域環(huán)境主要的重金屬污染物之一,是毒性最強的重金屬污染物。鎘對海洋生物,尤其是對底棲濾食性雙殼貝類的污染愈來愈嚴(yán)重。檢測發(fā)現(xiàn)泥蚶等貝類重金屬鎘超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重,但這些體內(nèi)富集高濃度Cd的泥蚶仍能繼續(xù)存活,并沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,從組織外觀上也大多沒有出現(xiàn)畸變。泥蚶對重金屬Cd的高富集性和強耐受性引發(fā)了我們的興趣和思考。探討灘涂貝類在重金屬Cd脅迫下的響應(yīng)機制和調(diào)控機制,不僅為后續(xù)篩選泥蚶抗逆品系提供技術(shù)支撐,而且能從中篩選得

2、到一些指示鎘污染程度的生物指標(biāo),可補充作為監(jiān)測重金屬污染的手段之一。
　　本研究分成兩部分,一是在實驗生態(tài)條件下,對鎘脅迫下泥蚶血紅蛋白濃度變化、分子水平的 mRNA表達變化進行了檢測,探索泥蚶血紅蛋白這一特異性的蛋白與鎘脅迫之間的相關(guān)性;二是構(gòu)建鎘脅迫下泥蚶m(xù)icroRNA文庫,分析泥蚶血液中差異表達 microRNA以及靶基因和調(diào)控通路的預(yù)測分析。主要結(jié)果如下:
　　1.鎘脅迫對泥蚶體內(nèi)血紅蛋白濃度的影響
　　采用

3、十二烷基硫酸鈉血紅蛋白測定試劑盒(SLS-Hb方法)相結(jié)合的方法測定泥蚶血紅蛋白的濃度。結(jié)果表明,在不同濃度重金屬鎘脅迫條件下,泥蚶血紅蛋白濃度具有明顯的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng),均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。實驗結(jié)果顯示,在25μg/L和250μg/L濃度重金屬脅迫下,在3h時血紅蛋白含量達到最高,分別為28.79μg/L、23.67μg/L;在重金屬濃度為500μg/L時,實驗組在3h和6h與對照組相比呈現(xiàn)下降趨勢,在9h時血紅蛋白含量顯著性

4、升高(P﹤0.05),血紅蛋白含量最高為23.03μg/L。初步研究結(jié)果表明,在重金屬鎘脅迫下泥蚶血紅蛋白濃度表現(xiàn)出一定的變化規(guī)律,短時間內(nèi)有一個應(yīng)激的快速增加,但隨著鎘脅迫時間的延長,血紅蛋白濃度呈現(xiàn)逐步降低的趨勢,為泥蚶血紅蛋白作為泥蚶Cd富集程度和重金屬鎘污染生物指標(biāo)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
　　2.鎘脅迫對泥蚶血紅蛋白mRNA表達變化的影響
　　采用熒光定量qRT-PCR法,研究鎘脅迫下泥蚶鰓中血紅蛋白mRNA的表達變

5、化,以及不同濃度梯度鎘對泥蚶鰓中血紅蛋白 mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)。Tg-HBⅠ在3h采樣點25μg/L是對照組表達量的3.8倍,在6h采樣點250μg/L實驗組表達量達到最大值是對照組的1.88倍;Tg-HBⅡA,500μg/L濃度組在3h表達量對照組的4.4倍,25μg/L、250μg/L濃度組在6h采樣點的表達量分別是對照組的3.94、5.17倍;在6h采樣點,三個實驗組(25μg/L、250μg/L、500μg/L)Tg-HBⅡB基因

6、的表達量分別是對照組的5.3、2.3、3.6倍。因此,初步研究表明泥蚶血紅蛋白Tg-HBⅠ、Tg-HBⅡA和Tg-HbⅡB與水體中重金屬Cd污染有一定相關(guān)性,隨著鎘脅迫時間的延長表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,不同血紅蛋白基因在應(yīng)激時間和表達程度上存在一些差異,這一結(jié)果與血液中血紅蛋白濃度變化趨勢相似,兩者結(jié)合,可作為泥蚶重金屬污染程度的一個生物學(xué)指標(biāo)。
　　3.泥蚶鎘脅迫下microRNA差異表達及靶向基因和通路預(yù)測
　　通

7、過重金屬鎘脅迫實驗,通過Illumina深度測序技術(shù)對泥蚶血液microRNA兩個文庫進行了測序。總計從對照組C和脅迫組E兩個文庫中獲得了13408818和12138445條序列。在對照組和實驗組文庫中共發(fā)現(xiàn)了215個保守的和39個新的 miRNAs。16個 miRNAs的表達量在對照組和鎘處理組之間有顯著性差異。其中在鎘脅迫組中,5個miRNAs顯著上調(diào),11個顯著下調(diào)。通過qRT-PCR驗證了其中表達最顯著的5個miRNA,即Tgr

8、-nmiR-8、Tgr-nmiR-21、Tgr-miR-2a、Tgr-miR-10a-5p和 Tgr-miR-184b,其中 Tgr-nmiR-8、Tgr-nmiR-21、Tgr-miR-2a是顯著上調(diào)(大于6倍),Tgr-miR-10a-5p和Tgr-miR-184b是顯著下調(diào)(大于5倍)。靶基因預(yù)測結(jié)果表明,差異表達 miRNA的靶基因大多數(shù)與免疫應(yīng)激,這些蛋白主要涉及細(xì)胞分化、增殖、凋亡,免疫應(yīng)答,炎癥反應(yīng),應(yīng)激反應(yīng)等,還有一些與