文昌紅樹林根際土壤小單孢菌的分離與菌株211018的鑒定.pdf

1、小單孢菌科是稀有放線菌中產(chǎn)生物活性物質(zhì)最多的一個科。為了開發(fā)紅樹林土壤中的小單孢菌資源,本研究從海南文昌頭苑紅樹林保護(hù)區(qū)采集23種紅樹植物的根際土壤,進(jìn)行小單孢菌的選擇性分離。
　　 采用自然風(fēng)干后濕熱55℃,20min的預(yù)處理,平板稀釋涂布法(10-1,10-2,10-3)將樣品懸浮液涂布于添加了重鉻酸鉀,放線菌酮,制霉菌素和新生霉素的1/10ATCC172選擇性培養(yǎng)基。最后僅從其中的7個土壤樣品中分離得到145株放線菌,經(jīng)形

2、態(tài)學(xué)觀察有96株為小單孢菌,另外的49株以鏈霉菌為主。這7種紅樹植物包括尖葉鹵蕨、海蓮、老鼠勒、海漆、銀葉樹、海芒果和黃瑾,其中從黃瑾的土壤樣品中分離得到的小單孢菌最多,為23株。從96株菌中挑選30株代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列分析,結(jié)果表明這30株菌全都分布在小單孢菌科的小單孢菌屬。
　　 對145株放線菌中的126株菌發(fā)酵培養(yǎng)7d,將其發(fā)酵液進(jìn)行活性篩選。結(jié)果顯示有4株具有抗HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞毒活性,5株具

3、有PTP1B抑制活性。其中有兩株菌抗HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞毒活性較強(qiáng),IC50分別為0.5234±0.088和3.227±0.522μg/nL;有一株菌PTP1B(protein tyrosine phosphatase1B)抑制活性較強(qiáng),IC50為3.41±0.58mL。從海蓮根系土壤分離得到的活性菌株最多。
　　 結(jié)合實(shí)驗(yàn)室收集的小單孢菌資源,選取了一株可能為小單孢菌新種的菌株211018進(jìn)行多相分類鑒定。菌株21101

4、8分離自紅樹植物海漆的根際土壤,16S rRNA基因序列分析表明與其相似率最高的兩株模式菌為Micromonospora olivasterospora DSM43868T:(=JCM7348T,98.6％)和Micromonospora pattaloongensis TJ2-2T(=JCM12833T,98.4％)。同時,gyrB基因序列分析也驗(yàn)證了菌株211018應(yīng)該屬于小單孢菌屬。菌株211018全細(xì)胞水解產(chǎn)物含葡萄糖,木糖,甘

5、露糖,核糖和阿拉伯糖,無鼠李糖,屬細(xì)胞壁D類糖型:含有meso-DAP(2,6-二氨基庚二酸),Gly和少許的DD-DAP,屬細(xì)胞壁Ⅱ型氨基酸:主要脂肪酸成分為I-C15.0(27.53％)、10-methyl C17:0(14.17％)、C17:1ω8c(12.78％)和I-C16:0(12.61％),類型為3b型;主要的甲基萘醌(menaquinone,MK)為MK-9(H4),MK-9(H6)和MK-9(H2);磷酸類脂包含磷脂酰

6、乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇甘露糖苷,屬PⅡ型;胞壁酸屬于羥基乙酰型;(G+C)mo1％為70.8mo1％。這些化學(xué)特征與小單孢菌屬的特征基本一致.另外,DNA-DNA雜交試驗(yàn)結(jié)果和一些生理生化特征顯示菌株211018與其相似率最高的兩株模式菌株存在差異?；诘玫降幕蛐秃捅硇吞卣?確定菌株211018是小單孢菌屬的一個新種,命名為Micromonospora rhizosphaerae sp.nov.,其16S rRNA