人cd59 rnai逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

1、<p>　　人CD59 RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定</p><p>　　作者：石學(xué)香 高美華 臧金林 </p><p>　　【摘要】 目的 利用siRNA表達(dá)載體法構(gòu)建并篩選攜帶針對(duì)CD59基因pSUPER retro RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞克隆。方法 用DNA重組技術(shù)，將3條60 bp能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向CD59小發(fā)夾RNA（shRNA）的寡核苷酸序列

2、定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER retro，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系Phoenix A，建立產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞克隆。結(jié)果 重組載體經(jīng)PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定初步成功后測(cè)序序列正確；重組載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，可表達(dá)綠色熒光蛋白，表明包裝成功。結(jié)論 特異性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞系構(gòu)建成功，為后續(xù)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)，可望為腫瘤治療開(kāi)辟新途徑。 </p>

3、<p>　　【關(guān)鍵詞】 RNA,雙鏈；抗原,CD59；轉(zhuǎn)染；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 </p><p>　　CD59是補(bǔ)體終末段的一種調(diào)節(jié)蛋白，具有抑制補(bǔ)體攻膜復(fù)合物的形成，保護(hù)細(xì)胞免遭補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用。FONSATTI等[1]研究顯示，CD59與腫瘤的生長(zhǎng)失控及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由于在大多數(shù)實(shí)體瘤細(xì)胞膜表面存在或者高表達(dá)CD59等一系列的膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，使得腫瘤細(xì)胞逃脫了自身的免疫監(jiān)視以及靶向單克隆抗體治

4、療中由補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用，免疫逃逸是導(dǎo)致眾多腫瘤治療方案失敗的重要原因[2,3]。目前，在實(shí)體腫瘤的免疫治療研究中，一個(gè)更加有效的策略是使腫瘤細(xì)胞膜上的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白失活或不表達(dá)。本研究選擇CD59作為靶基因，應(yīng)用RNA干涉（RNAi）技術(shù)，構(gòu)建攜帶針對(duì)CD59的pSUPER retro neo+gfp重組載體，以特異性沉默腫瘤細(xì)胞中CD59基因表達(dá)，觀察小發(fā)夾RNA（shRNA）對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用，以及靶基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和增

5、殖的影響。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 材料 </b></p><p>　　逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞Phoenix A及pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒均由我院羅兵教授惠贈(zèng)，大腸桿菌JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，靶向CD59的60 bp oligos

6、由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司；E.Z.N.A.Gel Extraction kit購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司。 </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 靶向CD59基因寡核苷酸的設(shè)計(jì) 應(yīng)用美國(guó)Oligo Engine公司提供的雙鏈RNA（siRNA

7、）設(shè)計(jì)軟件，將CD59的基因序列號(hào)輸入后，通過(guò)Blast搜索確認(rèn)與人的基因序列無(wú)同源性，選出3條序列（分別為218～236 bp，261～279 bp，318～336 bp）作為實(shí)驗(yàn)組。按照pSUPER質(zhì)粒說(shuō)明書(shū)中構(gòu)建發(fā)夾狀短鏈RNA的原則，設(shè)計(jì)序列分別為：T1組，5′GATCCCCGCGTGTCTCATTACCAAAGTTCAAGAGACTTTGGTAATGAGACACGCTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGCG

8、TGTCTCATTACCAAAGTCTCTTGAACTTTGGTAATGAGACACGCGGG3′；T2組，5′GATCCCCGTGTTGGAAGTTTGAGCATTTCAAGAGAATGCTCAAACTTCCAACACTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGTGTTGGAAGTTTGAGCATTCTCTTGAAATGCTCAAACTTCCAACACGGG3′；T3組，5′GATCCCCTGAGCTAA

9、CGTA</p><p>　　1.2.2 重組載體的構(gòu)建 本研究選用美國(guó)Oligo Engine公司的pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒作為載體，該載體有Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，兩位點(diǎn)之間為長(zhǎng)983 bp的填充序列，將該填充序列切下后，與上述合成的具有Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ黏性末端的60 nt的寡核苷酸雙鏈連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒。 </p><p>　　1.2.3

10、 重組載體的鑒定 PCR初步驗(yàn)證重組載體的正確性，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為包括插入序列及其兩側(cè)部分堿基的一段長(zhǎng)度為395 bp的核苷酸，引物序列如下: pSUPERa:5′CCTTTATCCAGCCCTCACTC3′，pSUPERs:5′AGACTGCCTTGGGAAAAGCG3′。分別以重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59及空質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。陽(yáng)性克隆可觀察到長(zhǎng)為395 bp條帶，而空質(zhì)?？捎^察到長(zhǎng)1 318 b

11、p條帶。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59以及對(duì)照空質(zhì)粒，37 ℃水浴過(guò)夜，次日各取10 μL于10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。陽(yáng)性克隆可觀察到長(zhǎng)為281 bp條帶,而空質(zhì)?？捎^察到長(zhǎng)為1 204 bp條帶。為進(jìn)一步驗(yàn)證插入序列的準(zhǔn)確性，把堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA及過(guò)夜搖菌的產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測(cè)序。 </p><p>　　1.2.4 轉(zhuǎn)染包裝

12、細(xì)胞系Phoenix A 雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系Phoenix A，培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、105 U/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM，于37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，按說(shuō)明書(shū)利用脂質(zhì)體Lipofectine 2000（Invitrogene）將重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59導(dǎo)入Phoenix A細(xì)胞，48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。 <

13、/p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果 </p><p>　　該質(zhì)粒全長(zhǎng)8 371 bp，Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ兩酶切位點(diǎn)之間的序列長(zhǎng)為983 bp，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ將質(zhì)粒雙酶切后，可觀察到長(zhǎng)983 bp和7 388 b

14、p的DNA片段。 </p><p>　　2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 </p><p>　　取4 μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并取空質(zhì)粒為陰性對(duì)照。電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)?？捎^察到長(zhǎng)395 bp的條帶，而空質(zhì)?？捎^察到長(zhǎng)為1 318 bp的條帶。見(jiàn)圖1。 </p><p>　　2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 </p><p>　　選取

15、ALB平板上的可疑菌落搖菌后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，取10 μL酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并選取空質(zhì)粒作為對(duì)照。電泳結(jié)果顯示，空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒均觀察到長(zhǎng)7 167 bp的DNA條帶，但空質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的較小的DNA片段長(zhǎng)為1 204 bp，而重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59則長(zhǎng)為281 bp。見(jiàn)圖2。 </p><p>　　2.4 靶序列鑒定 </p><p>　　重

16、組質(zhì)粒pSUPERsiCD59的測(cè)序結(jié)果與我們?cè)O(shè)計(jì)合成的T1、T2、T3、C組的序列完全一致，結(jié)果表明長(zhǎng)60 bp的寡核苷酸插入pSUPER載體，靶向CD59基因的pSUPERsiCD59載體構(gòu)建成功。 </p><p>　　2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝 </p><p>　　重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix A，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察

17、到綠色熒光，說(shuō)明包裝出的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染性。 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　CD59是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)分子質(zhì)量為18 000～20 000的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，其最重要的功能是通過(guò)阻止補(bǔ)體攻膜復(fù)合物(MAC)的裝配以保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體溶破[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)實(shí)體瘤細(xì)胞膜表面存在或者高表達(dá)CD59 等一系列的

18、膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，提示CD59與腫瘤的失控性生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。目前，在實(shí)體腫瘤的免疫治療中，一個(gè)更加有效的策略是使腫瘤細(xì)胞膜上的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白失活或不表達(dá)。 </p><p>　　圖1 重組質(zhì)粒PCR反應(yīng)產(chǎn)物鑒定電泳（略） </p><p>　　M:Maker DL2000;①～④:分別為重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59T1、T2、T3、C;⑤～⑥：空質(zhì)粒;⑦：陰性對(duì)照 </

19、p><p>　　圖2 EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒鑒定電泳 </p><p>　　M: Maker DL2000 ①、②:空質(zhì)粒;③～⑥:重組質(zhì)粒pSUPERsiCD59T1、T2、T3、C </p><p>　　RNAi是自然界中普遍存在的一種重要的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。文獻(xiàn)報(bào)道，用人工合成19～23 nt siRNA直接轉(zhuǎn)染或shRNA經(jīng)載體介導(dǎo)后轉(zhuǎn)染

20、靶細(xì)胞可誘導(dǎo)RNAi，能產(chǎn)生對(duì)相應(yīng)序列mRNA的特異性降解[5]。鑒于CD59基因的過(guò)度表達(dá)是腫瘤免疫逃逸導(dǎo)致眾多腫瘤治療方案失敗的重要原因，故可作為選擇性干預(yù)的靶基因。目前，制備siRNA的方法主要有兩類，即體外制備和體內(nèi)表達(dá)，兩者最大的不同在于前者直接作用于RNA，而后者的對(duì)象則是DNA。根據(jù)具體工具不同可進(jìn)一步劃分為5種RNAi實(shí)驗(yàn)方法，即化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、制備siRNA混合物、siRNA表達(dá)盒子和siRNA表達(dá)載體法。si

21、RNA表達(dá)載體法的特點(diǎn)是由RNA聚合酶啟動(dòng)子（polⅢ）啟動(dòng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，另外有4～5個(gè)T組成的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，常用RNA聚合酶啟動(dòng)子包括人和鼠的U6啟動(dòng)子以及人H1啟動(dòng)子等3種。選擇RNA polⅢ是因?yàn)樗偸窃陔x啟動(dòng)子固定距離的位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，遇到4～5個(gè)連續(xù)的U即在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的第2個(gè)堿基處終止，非常精確[6]。由于質(zhì)?？梢栽诩?xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增，這種帶有抗生素抗性標(biāo)記的載體抑制基因，表達(dá)的效果可持續(xù)幾周甚至更長(zhǎng)，這使之</p>

22、<p>　　本文用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體系構(gòu)建針對(duì)CD59的shRNA轉(zhuǎn)錄載體。攜帶靶序列pSUPERsiCD59載體是帶有新霉素抗性基因和綠色熒光蛋白編碼基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體帶有依賴RNA聚合酶Ⅲ的H1啟動(dòng)子，可轉(zhuǎn)錄生成針對(duì)靶基因的shRNA，在體內(nèi)再加工生成雙鏈的小干涉RNA，進(jìn)而降解相應(yīng)的靶mRNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染分裂期細(xì)胞，使目的基因穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞基因組，能長(zhǎng)期表達(dá)，而且不產(chǎn)生輔助病毒，具有很好的安全性[7

23、]。本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雙嗜性包裝細(xì)胞Phoenix A，包裝成功的Phoenix A細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，獲得可以感染靶細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒能產(chǎn)生針對(duì)靶基因CD59的shRNA，使靶基因的mRNA降解，為更深入地探討CD59基因沉默對(duì)CD59陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖分化影響，進(jìn)而為用于CD59相關(guān)腫瘤的治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】

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