攜帶GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其在癲癇鼠海馬神經(jīng)發(fā)生中的應(yīng)用研究.pdf

1、癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，以大腦神經(jīng)元異常放電所致的短暫性腦功能障礙為特征。近年來(lái)對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制的研究取得了很多進(jìn)展并提出眾多假說(shuō)但癲癇具體發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。大量研究表明癲癇發(fā)作后的神經(jīng)發(fā)生異常不但和癲癇相關(guān)的認(rèn)知功能障礙有關(guān)，而且與海馬硬化、突觸重塑和異常神經(jīng)環(huán)路形成等導(dǎo)致自發(fā)、復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作的病理進(jìn)程有關(guān)。因此癲癇發(fā)作后的異常神經(jīng)發(fā)生成為近年來(lái)癲癇研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)。
　　通過(guò)免疫組化的方法，課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)：大

2、鼠癲癇發(fā)作后，海馬亞顆粒增生帶產(chǎn)生的新生神細(xì)胞異常遷移至門區(qū)，形成異位神經(jīng)元。此外，通過(guò)離體研究，我們發(fā)現(xiàn)促炎性因子白介素-1β對(duì)離體培養(yǎng)神經(jīng)元的遷移具有引導(dǎo)作用。這些結(jié)果提示癲癇發(fā)作可能導(dǎo)致IL-1β表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致新生神經(jīng)元遷移異常，形成海馬門區(qū)的異位神經(jīng)元，最終成為癲癇反復(fù)發(fā)作的根源之一。但目前缺乏更多的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)支持這一結(jié)論。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為一種常用的分子生物學(xué)工具，利用攜帶GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體標(biāo)記海馬新生神經(jīng)細(xì)胞可以清晰的

3、觀察到新生神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)并可長(zhǎng)期觀察，故在研究癲癇發(fā)作對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生的影響方面與常規(guī)方法相比具有很大優(yōu)勢(shì)。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)并完成了本課題，以期進(jìn)一步驗(yàn)證癲癇發(fā)作后新生細(xì)胞的遷移模式并對(duì)其可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　目的：
　　構(gòu)建攜帶 GFP的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并用以研究癲癇發(fā)作對(duì)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響；觀察癲癇發(fā)作后大鼠海馬區(qū)IL-1βmRNA及蛋白表達(dá)的變化；構(gòu)建針對(duì)IL1R1的siRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。

4、　　方法：
　　1、利用MSCV-IRES-GFP質(zhì)粒，通過(guò)質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、病毒包裝等步驟構(gòu)建攜帶綠色熒光（GFP）的逆轉(zhuǎn)錄病毒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、建立氯化鋰-匹魯卡品大鼠癲癇模型，建模后一周通過(guò)大腦立體定位注射技術(shù)將逆轉(zhuǎn)錄病毒注入大鼠海馬門區(qū)，并以正常大鼠作為對(duì)照，通過(guò)免疫熒光法觀察逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記新生細(xì)胞的遷移并探討 IL-1β的作用；通過(guò)Real-time PCR和Western blot等技術(shù)觀察IL-1βmRNA和蛋

5、白表達(dá)的變化。
　　3、基于MSCV-IRES-GFP構(gòu)建針對(duì)IL1R1的siRNA重組質(zhì)粒，通過(guò)質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、病毒包裝等步驟構(gòu)建針對(duì)IL-1R1的siRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。
　　結(jié)果：
　　1、構(gòu)建含有GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包裝完成后感染細(xì)胞，可觀察到48小時(shí)后約有80％-90％的細(xì)胞表達(dá)GFP，說(shuō)明病毒包裝成功。
　　2、對(duì)照組大鼠海馬亞顆粒增生帶產(chǎn)生的新生細(xì)胞向分子細(xì)胞層遷移，模型組大鼠在癲癇發(fā)作后，海

6、馬新生細(xì)胞數(shù)目增多且異常遷往齒狀回門區(qū)，部分細(xì)胞頂樹突伸向門區(qū)。與對(duì)照組相比，癲癇模型組大鼠海馬 IL-1β的mRNA及蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯的上調(diào)（p<0.05）。
　　3、測(cè)序結(jié)果證實(shí)針對(duì)IL1R1的siRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，包裝成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒后，細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)顯示48小時(shí)后90％細(xì)胞被逆轉(zhuǎn)錄病毒成功感染；Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比病毒感染細(xì)胞內(nèi) IL-1R1的mRNA表達(dá)降低。
　　結(jié)論：