重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXSN-GDNF轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建GDNF基因修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs),為組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒(第三軍醫(yī)大學(xué)阮懷珍教授惠贈)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌并進(jìn)行抗性篩選,抽提純化質(zhì)粒。酶切、測序檢測目的基因的正確性。
　　 2.復(fù)蘇包裝細(xì)胞PA317,用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增,待細(xì)胞生長至80％融合時,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組逆轉(zhuǎn)錄病

2、毒PLXSN-GDNF轉(zhuǎn)染進(jìn)入PA317包裝細(xì)胞,G418篩選產(chǎn)毒克隆細(xì)胞,收集病毒上清液并測定病毒滴度。
　　 3.取健康剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦捐獻(xiàn)的臍帶,用組織塊法培養(yǎng)獲得原代細(xì)胞、胰酶消化傳代,取第2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs),免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞表面抗原CD44、CD105、CD106、CD34、CD45的表達(dá)情況。
　　 4.病毒上清感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,即GDNF-UCMSCs,收集細(xì)胞并用反轉(zhuǎn)

3、錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測GDNF在mRNA水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.XholⅠ單酶切重組質(zhì)粒,出現(xiàn)0.66kb和5.93kb兩個片段,與預(yù)期結(jié)果相符。測序檢測結(jié)果顯示重組逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN-GDNF中大鼠GDNF的編碼序列完整。
　　 2.用小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度,挑選四個克隆檢測,最高病毒滴度為6.56×104cfu/ml,選用該病毒上清液感染細(xì)胞。
　　

4、 3.原代培養(yǎng)1周時組織塊之間出現(xiàn)貼壁的成纖維樣細(xì)胞,14天左右集落細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合,成螺旋狀或放射狀。免疫組化檢測細(xì)胞表面抗原示:CD44、CD105強(qiáng)陽性,CD106弱陽性,CD34、CD45陰性,與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)的生物學(xué)特性相符。
　　 4.RT-PCR法檢測顯示,GDNF-UCMSCs組呈陽性,而UCMSCs組呈陰性,轉(zhuǎn)基因組GDNF mRNA水平表達(dá)明顯強(qiáng)于對照組,P＜0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)