牛免疫缺陷病毒微管依賴性運輸?shù)难芯?pdf

1、牛免疫缺陷病毒(BIV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬,與人免疫缺陷病毒(HIV)在形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)方面具有很高的同源性。BIV是一種非致癌病毒,在感染的牛群體內(nèi),誘發(fā)中樞系統(tǒng)損傷和白細胞增生；在體外培養(yǎng)細胞中,誘導(dǎo)合胞體的產(chǎn)生。與其他慢病毒相同,BIV感染細胞后將自身RNA基因組反轉(zhuǎn)錄成為DNA,并以原病毒形式整合到宿主染色體。病毒是細胞的嚴格寄生物,必須借助宿主細胞的機制完成自身的各種生命活動。在感染早期,病毒顆粒需要從細胞邊緣移動到細胞核

2、附近進而完成復(fù)制。通過劫持馬達蛋白沿著微管運動,是病毒運輸?shù)钠毡闄C制。作為細胞的通道,微管是平行排列的αβ微管蛋白二聚體構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu),兩端具有極性。在非極性細胞中,微管正極指向細胞膜,負極指向微管組織中心。病毒從細胞邊緣到細胞核的運動是向微管負極的運輸,稱為反向運輸,常需要動力蛋白(dynein)的參與；病毒從細胞核周到細胞邊緣的運動是向微管正極的運輸,稱為正向運輸,需要驅(qū)動蛋白的參與。病毒蛋白與馬達蛋白亞基的相互作用被認為是病毒運輸

3、的關(guān)鍵。
　　 本文利用指示細胞的方法檢測微管藥物對BIV感染的影響,發(fā)現(xiàn)BIV在nocodazole處理過的細胞中的感染性顯著下降,nocodazole對BIV感染的抑制作用發(fā)生在感染早期并且具有劑量依賴性。通過微管組分分離實驗和對微管蛋白乙酰化的檢測,發(fā)現(xiàn)BIV感染可以促進微管的聚合與穩(wěn)定。為了進一步確定微管是否參與BIV的運輸,通過免疫熒光顯微鏡觀察了病毒顆粒在不同感染時期的亞細胞定位。感染后2小時,BIV病毒顆粒幾乎都位

4、于細胞邊緣,感染8小時后移動到細胞核附近。而在nocodazole處理的細胞中,大部分病毒顆粒在感染后8小時仍定位于細胞邊緣。對病毒顆粒的定量分析顯示,與正常細胞相比,nocodazole使細胞核區(qū)病毒顆粒數(shù)目明顯下降。此外,在免疫熒光顯微鏡和電鏡下,我們觀察到正在運輸?shù)牟《绢w粒定位在微管上。這些結(jié)果證明BIV的反向運輸依賴于微管。利用過表達Dynamitin使dynein功能受損的方法,檢測了dynein是否參與BIV的生活周期。在D

5、ynamitin過表達的細胞中,BIV的感染性顯著下降。進一步免疫熒光實驗證明了BIV感染性的下降是由于病毒顆粒反向運輸受阻造成的。這些結(jié)果證明dynein是介導(dǎo)BIV反向運輸?shù)鸟R達蛋白。利用酵母雙雜交篩選,我們發(fā)現(xiàn)BIV衣殼蛋白CA與dynein輕鏈亞基LC8存在相互作用；通過GST-pulldown、CBP-pulldown和Co-IP實驗,證明CA在體內(nèi)、體外和病毒感染條件下均可以與LC8相互作用。在CA蛋白中,LC8結(jié)合區(qū)位于C

6、A蛋白N端結(jié)構(gòu)域。向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA可以下調(diào)LC8的表達。BIV在LC8受損的細胞中感染性顯著下降。在免疫熒光顯微鏡下,這些細胞中BIV的反向運輸被阻斷。微管組分分離實驗顯示,在BIV感染早期,正常細胞中CA蛋白主要存在于微管組分中,而在LC8受損細胞中CA蛋白多存在于細胞漿中。進一步的Co-IP實驗證明CA可以通過LC8結(jié)合到dynein復(fù)合物上,這一結(jié)果與熒光顯微鏡下觀察到運輸中的病毒顆粒與GFP標(biāo)記的dynein復(fù)合物具有共

7、定位的現(xiàn)象相一致。此外,過轉(zhuǎn)染CA可以有效抑制 BIV的感染,這可能是由于過剩的CA蛋白與病毒競爭性結(jié)合LC8導(dǎo)致的。以上結(jié)果證明LC8是BIV運輸中連接病毒顆粒與微管的關(guān)鍵因子。本文首次描述了微管依賴性的BIV反向運輸,并闡明了BIV運輸?shù)姆肿訖C制,豐富了人們對BIV生活周期的認識。通過BIV運輸分子基礎(chǔ)的揭示,對HIV乃至整個反轉(zhuǎn)錄病毒的相關(guān)研究具有重要的借鑒意義。所有慢病毒的研究都是以攻克艾滋病為最終目標(biāo)的,我們從病毒反向運輸這個