雞毒支原體轉(zhuǎn)座篩選方法的建立及兩種膜相關(guān)酶的特性研究.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,MG)屬于柔膜體綱、支原體目、支原體科,主要引起雞以及其它禽類的慢性呼吸道疾病,特別是在應(yīng)激狀態(tài)或存在呼吸道病原體的情況下。雞毒支原體感染和寄生最重要的步驟是借助于表面的膜蛋白黏附于呼吸道黏膜固有層。為進(jìn)一步研究雞毒支原體對宿主的感染和寄生作用,本實(shí)驗對TpiA和LicA這兩種與致病力相關(guān)的膜相關(guān)酶進(jìn)行了特性研究,并在實(shí)驗室原有的轉(zhuǎn)座載體上進(jìn)行了改造,建立了轉(zhuǎn)座篩選的方法。<

2、br>　　 1.轉(zhuǎn)座篩選方法的建立
　　 mini-Tn4001tetM是本實(shí)驗以前構(gòu)建的轉(zhuǎn)座載體,以四環(huán)素為抗性篩選基因,但由于四環(huán)素的篩選范圍較窄,不利于轉(zhuǎn)座操作。因此,本實(shí)驗中將編碼四環(huán)素的抗性基因替換成編碼慶大霉素的抗性基因,并通過抗性基因的PCR擴(kuò)增、DF1黏附、玻片黏附、SDS-PAGE、Western-blot及質(zhì)譜鑒定等方法對隨機(jī)缺失株進(jìn)行篩選,建立了比較完整的轉(zhuǎn)座篩選方法。
　　 2.磷酸丙糖異構(gòu)酶的

3、生物學(xué)特性研究
　　 磷酸丙糖異構(gòu)酶為糖酵解途徑中的重要酶。根據(jù)Rlow株的磷酸丙糖異構(gòu)酶的已知序列設(shè)計引物,擴(kuò)增tpiA基因。將點(diǎn)突變后的tpiA克隆入pET28a(+)載體中,進(jìn)行原核表達(dá),結(jié)果呈高效可溶性表達(dá)。利用His-Band Resin對上清進(jìn)行純化。通過UV交聯(lián)的方法獲得了二聚體磷酸丙糖異構(gòu)酶,利用純化的rTpiA免疫BALB／c小鼠制備多克隆抗體,并對純化的rTpiA進(jìn)行了酶活性驗證,測定出rTpiA相對比活力為

4、3928IU／mg；并確定其最適溫度為37℃左右,最適pH為7-8之間,另外TpiA參與了雞毒支原體對DFI細(xì)胞的黏附和入侵。
　　 3.LicA的生物學(xué)特性研究
　　 支原體licA基因編碼脂寡糖／脂多糖(Lipooligosaccharide／Lipopolysaccharide,LOS／LPS)合酶或膽堿激酶,催化合成磷酸膽堿。為深入研究licA基因及其產(chǎn)物的生物學(xué)活性,本研究利用Overlap-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得

5、雞毒支原體licA基因,將該基因經(jīng)酶切克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)中,利用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,LicA呈現(xiàn)包涵體表達(dá),利用His-BandResin對包涵體進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物作為免疫原腹腔注射BALB／c小鼠,制備獲得LicA多克隆抗體。通過對雞毒支原體不同強(qiáng)弱毒株膜蛋白提取物進(jìn)行Western-blot檢測,發(fā)現(xiàn)在所有參試毒株中,LicA表達(dá)量恒定,并呈現(xiàn)膜定位特性。這為下一步在體外建立L