雞毒支原體的分離和巢氏PCR鑒定研究.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是引發(fā)雞的慢性呼吸道病(Chronic respiratorydisease，CRD)的病原菌，能夠引起雞的咳嗽、流鼻液、呼吸道噦音、和氣囊炎等呼吸道疾病。此病易傳染，常引發(fā)雞群的群體發(fā)病，但死亡率不高，常常是隱性帶菌雞，導致蛋雞產(chǎn)蛋率下降，蛋的孵化率變低，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的損失。 針對重慶地區(qū)24個養(yǎng)雞場中的疑似感染病例進行病原分離培養(yǎng)，病料在25％的青霉素溶

2、液中浸泡24h后，取出200μL于改良后添加了醋酸鉈的Hartleys培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，2-3天后觀察可見長出油煎蛋樣外觀菌落，瑞氏染色鏡檢有細小球形、短桿狀和不規(guī)則的藍色菌體，由此可初步認定分離物為支原體。經(jīng)生化反應，分離菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸，添加酚紅的液體培養(yǎng)基顏色也由紅變?yōu)辄S色。此菌能夠吸附紅細胞，與MG—S6株血清反應，其代謝抑制價在1：80～1：1280之間，確認為MG陽性。從17株分離物中篩選出來9株雞毒支原體進行初步研究。

3、 用primer premier5.0引物設計軟件對雞毒支原體分離物保守序列，即16S/23S rRNA基因間隔區(qū)的序列設計兩對引物，分別擴增577bp序列和其內(nèi)部283bp序列，做巢氏PCR鑒定。通過對PCR條件的探索，改變條件以至于達到最好的擴增結果。首次擴增可見較暗的目的條帶，然后用首次擴增的產(chǎn)物經(jīng)過500倍稀釋作為模板進行第二次擴增，電泳結果可見明亮的目的條帶。在此實驗中對照組均無目的條帶。由此可以將本實驗分離的重慶地區(qū)雞毒

4、支原體疑似株鑒定為雞毒支原體分離株。然后利用限制性內(nèi)切酶RasⅠ對第二次擴增產(chǎn)物片段進行限制性片段長度多態(tài)性分析，雞毒支原體分離物經(jīng)電泳分析可顯示兩種不同的酶切圖譜，全部分離菌株均表現(xiàn)255/28型，即片段上只有一個RsaⅠ位點，被酶切為255bp和28bp兩個片段，說明雞毒支原體在基因型上不存在差異。 用目前國內(nèi)外檢測和提取細菌質粒的方法對雞毒支原體進行研究，先參照堿裂解法配制試劑對雞毒支原體培養(yǎng)物進行抽提，然后用國內(nèi)成熟提取