miR-99a與miR-146c在雞毒支原體感染中的作用研究.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是禽類支原體感染中最重要的病源微生物之一，引起禽類的慢性呼吸道疾病(chronic respiratory disease，CRD)，該病廣泛分布于世界上所有養(yǎng)禽的國家，對家禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　microRNAs是一類長度18-25nt的非編碼微小分子RNAs，主要通過識別特殊序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)外界病原微生物進(jìn)入宿主后，宿主體內(nèi)miRNAs

2、呈現(xiàn)不同豐度的表達(dá)，且在病原微生物感染不同時期以及由于病原微生物種類的不同，宿主體內(nèi)miRNAs表達(dá)量發(fā)生變化。因此，通過研究宿主細(xì)胞感染病原前后miRNAs的表達(dá)變化及其靶標(biāo)功能，不僅有助于揭示了該病的致病機(jī)制，還為實現(xiàn)基因治療提供理論依據(jù)。
　　本實驗組前期通過MG感染雞胚，深度測序發(fā)現(xiàn)，處理組中g(shù)ga-miR-99a的表達(dá)量顯著下調(diào)，gga-miR-146c的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明gga-miR-99a、gga-miR-146

3、c可能在MG引起的疾病中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　本研究主要運(yùn)用Q-PCR研究不同時期MG感染雞胚肺組織中miR-99a和miR-146c的表達(dá)量;通過生物信息學(xué)方法預(yù)測靶基因，并進(jìn)行驗證;利用超表達(dá)和RNAi技術(shù)研究靶基因的功能，初步闡明gga-miR-99a、gga-miR-146c在MG感染中的調(diào)控機(jī)制。本研究的主要成果如下:
　　(1)采用Q-PCR檢測不同時期MG感染雞胚肺組織中miR-99a的表達(dá)量，13d、14d、1

4、6d、17d肺組織中g(shù)ga-miR-99a的相對表達(dá)量在感染MG后極顯著上調(diào)(p＜0.01)，12d、15d、19d、20d肺組織中g(shù)ga-miR-99a的相對表達(dá)量在感染MG后極顯著下調(diào)(p＜0.01)。
　　(2)通過TargetScan和miRDB預(yù)測gga-miR-99a的靶基因，初步選定SMARCA5作為gga-miR-99a的靶基因。進(jìn)一步運(yùn)用雙熒光素酶報告基因驗證，結(jié)果顯示，與NC組、突變載體組、空載體組相比，gga

5、-miR-99a能夠極顯著抑制SMARCA53'UTR的雙熒光素酶報告基因的表達(dá)(p＜0.01)。同時，DF-1細(xì)胞中超表達(dá)gga-miR-99a后，與NC組相比，SMARCA5相對表達(dá)量極顯著下調(diào)(p＜0.01);抑制gga-miR-99a后，與Inhibitor NC相比，SMARCA5相對表達(dá)量極顯著上調(diào)(p＜0.01)。此外，12d感染組肺組織中SMARCA5的相對表達(dá)量極顯著上調(diào)(p＜0.01);16d感染組肺組織中SMARC

6、A5的相對表達(dá)量極顯著下調(diào)(p＜0.01)，該結(jié)果與同時期肺組織中g(shù)ga-miR-99a的表達(dá)趨勢相反。
　　(3) DF-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染gga-miR-99a24h、48h、72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染72h后，DF-1細(xì)胞增殖率顯著下降(P＜0.05);同時，轉(zhuǎn)染gga-miR-99a后檢測DF-1細(xì)胞周期，與陰性對照相比，G1期水平明顯升高(P＜0.05)， G2期基本保持不變(P＞0.05)。
　　(4)采用Q-PCR檢測不

7、同時期MG感染雞胚肺組織中miR-146c的表達(dá)量，13d、14d極顯著下調(diào)(p＜0.01)，而18d、19d、20d極顯著上調(diào)(p＜0.01);16d、17d顯著上調(diào)(p＜0.05)。
　　(5)通過TargetScan和miRDB預(yù)測gga-miR-146c的靶基因，初步選定MMP16、TRAF7作為gga-miR-146c的靶基因。進(jìn)一步運(yùn)用雙熒光素酶報告基因驗證，結(jié)果顯示，與NC組、突變載體組、空載體組相比，gga-miR

8、-146c能夠極顯著抑制MMP16、TRAF73'UTR的雙熒光素酶報告基因的表達(dá)(p＜0.01)。同時，DF-1細(xì)胞中超表達(dá)gga-miR-146c后，與NC組相比，MMP16、TRAF7的相對表達(dá)量極顯著下調(diào)(p＜0.01);抑制gga-miR-146c后，與Inhibitor NC相比，MMP16、TRAF7相對表達(dá)量極顯著上調(diào)(p＜0.01)。
　　(6)DF-1細(xì)胞中超表達(dá)gga-miR-146c后，與NC組相比，TLR