雞毒支原體GrpE粘附特性及引起IL--1β釋放的研究.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)主要宿主為雞和火雞，通過(guò)表面脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白（lipid-associated membrane proteins，LAMPs）來(lái)粘附和感染宿主細(xì)胞，是一種引起雞慢性呼吸道疾病的病原微生物。
　　為了篩選出MG LAMPs中關(guān)鍵粘附蛋白，本實(shí)驗(yàn)室前期利用快速蛋白液相色譜儀(fast proteinliquid chromatography，F(xiàn)PLC)和質(zhì)譜(mass

2、 spectrometry，MS)分析并鑒定了MG LAMPs中的成分，其中包括熱休克蛋白GrpE，在相關(guān)試驗(yàn)基礎(chǔ)上將熱休克蛋白GrpE作為候選蛋白。原核表達(dá)MG GrpE基因并獲得重組蛋白GrpE(rGrpE)單克隆抗體(MAb)。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果顯示GrpE定位于MG膜表面;流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)和激光共聚焦試驗(yàn)結(jié)果表明rGrpE能粘附于DF-1細(xì)胞表面，并且rGrpE MAb能顯著抑制MG LAMPs對(duì)DF-1細(xì)胞的粘附;夾心ELISA

3、試驗(yàn)結(jié)果表明rGrpE對(duì)DF-1細(xì)胞的粘附存在劑量依賴性，并且與MG陽(yáng)性血清的含量呈負(fù)相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rGrpE具有粘附到DF-1細(xì)胞表面的能力，并且這種粘附作用能被MG的陽(yáng)性血清所抑制，同時(shí)rGrpE MAb能顯著的抑制MG LAMPs對(duì)DF-1細(xì)胞的粘附。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明熱休克蛋白GrpE是雞毒支原體的一個(gè)新的粘附蛋白。
　　病原微生物具有的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular p

4、atterns，PAMPs)能被宿主細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別引起下游炎性細(xì)胞因子的釋放，如IL-1β、TNF-a、IL-6、IL-12等。這些炎性細(xì)胞因子在清除病原微生物感染等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。已有研究證實(shí)MG LAMPs不僅能促進(jìn)MG定植于宿主細(xì)胞表面，還能被宿主細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體結(jié)合，繼而激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-1β釋放。但是關(guān)于LAMPs中哪

5、些蛋白在執(zhí)行這樣的功能還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用DF-1細(xì)胞探究了rGrpE是否具有這樣的功能。SYBR GreenⅠ Real-time PCR和ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明rGrpE刺激DF-1細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)IL-1β的釋放，并且呈劑量依賴性;Western blot試驗(yàn)表明rGrpE能夠誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞p65磷酸化;激光共聚焦掃描顯微鏡可觀察到rGrpE誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞p65入核;SYBR GreenⅠ Real-timePCR和