捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H15 ES抗原基因的原核表達(dá)及重組蛋白間接ELISA方法的建立.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病是由捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）引起的寄生蟲病。感染牛、羊、鹿、牦牛、駱駝等反芻動物。該病呈世界性分布。在我國各地均有報(bào)道，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要采用化學(xué)藥物治療，但藥物殘留和環(huán)境污染嚴(yán)重。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲對驅(qū)蟲藥普遍具有抗藥性，并且感染后通常不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。為了有效控制該病，快速準(zhǔn)確的檢測方法和預(yù)防接種顯得尤為重要。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank中已發(fā)表的序列（U

2、64792）為參考設(shè)計(jì)并合成引物，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H15 ES抗原基因，并進(jìn)行了克隆與序列分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H15 ES抗原基因全長為453bp，包含完整的開放閱讀框，編碼148個(gè)氨基酸殘基。所得序列與GenBank已知序列核苷酸同源性為99.78％，氨基酸同源性為100％。
　　 利用生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)絡(luò)平臺對H15 ES抗原蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性及表面可能性、抗原性進(jìn)行了分析，綜合

3、評價(jià)了H15 ES抗原蛋白的抗原特異性細(xì)胞表位，并計(jì)算出一些潛在的抗原位點(diǎn)；Psort 分析顯示該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為66.7％，ProtFun預(yù)測提示該蛋白為酶的可能性為0.361，該蛋白具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、應(yīng)激應(yīng)答功能的可能性較高。
　　 利用PCR技術(shù)，從pMD18-T-H15ES重組質(zhì)粒中擴(kuò)增H15 ES抗原基因片段，重組到原核表達(dá)載體pET32a(+)中。將重組原核表達(dá)載體pET32a-H15 ES轉(zhuǎn)入大腸桿

4、菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，由SDS-PAGE電泳分析證實(shí)H15 ES基因獲得了表達(dá)，重組蛋白分子量大約是35.2ku，該重組蛋白以包涵體的形式存在。經(jīng)Westen-blot分析證實(shí)表達(dá)的重組蛋白具有良好的抗原性。
　　 通過Ni-NTA系統(tǒng)對H15 ES重組蛋白進(jìn)行純化，以純化的重組蛋白作為檢測抗原建立間接ELISA檢測方法。矩陣試驗(yàn)確定最適包被濃度為2μg/ml，血清的最佳稀釋度為1：200，ELISA陽性反應(yīng)的臨界值為O