Pib結(jié)構(gòu)基因在不同啟動子驅(qū)動下的稻瘟病抗性.pdf

1、稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea Barr［無性世代為Pyricularia grisea Saco.］所引起的真菌性水稻病害（Herbert,1971），與紋枯病、白葉枯病并稱為水稻的三大主要病害；幾乎在每個栽培水稻的國家和地區(qū)都有此病發(fā)生，只要條件適宜，就容易流行成災(zāi)，甚至顆粒無收.解決這一難題的辦法是培育抗病品種，通過基因工程方法將抗病基因?qū)胨靖胁∑贩N，對水稻抗病育種有著十分重要的理論意義和應(yīng)用價值。

2、>　　 Pib基因是水稻中通過圖位克隆方法得到第一個抗稻瘟病主效基因(Wang Z X et al,1999)，屬于NBS-LRR抗病基因家族。該基因全長10322bp，包含3個外顯子4個內(nèi)含子，其中前兩個內(nèi)含子位于翻譯起始密碼子ATG上游區(qū)域。整個基因編碼一個由1251個氨基酸組成的多肽，在氨基端NBS區(qū)含有Kinase la,2a和3a基序的重復(fù)結(jié)構(gòu)，在羧基端的17段LRRs中存在兩段由8個簇狀排列半胱氨酸殘基組成的結(jié)構(gòu)，這在其它

3、R基因中并沒有發(fā)現(xiàn)。Pib基因的克隆為在分子水平研究抗病基因結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系提供了材料。
　　 根據(jù)Pib基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本研究利用CaMV35 S+Pib雙啟動子、CaMV35S啟動子以及Pib啟動子來驅(qū)動Pib基因全長結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，相應(yīng)載體分別命名為pNAR701、pNAR704和pNAR705，探索不同啟動子驅(qū)動Pib結(jié)構(gòu)基因mRNA量的差異以及由此所造成的稻瘟病抗性，并探討啟動子與抗病基因功能之間的關(guān)系。同時，利用

4、CaMV35S啟動子分別驅(qū)動Pib基因的第1、第3外顯子的正/反義片段，分別構(gòu)建了pNAR707/pNAR708和pNAR702/pNAR703表達(dá)載體，用以探索Pib結(jié)構(gòu)基因不同片段與稻瘟病抗性之間的關(guān)系。為更進(jìn)一步闡明Pib基因的功能，本研究根據(jù)Pib基因保守區(qū)的特點(diǎn)設(shè)計引物，構(gòu)建了CaMV35S啟動子驅(qū)動的Pib基因保守區(qū)的干擾表達(dá)載體pNAR706，從反向遺傳學(xué)的角度對Pib基因的功能進(jìn)行研究。
　　 對上述獲得的雙元表

5、達(dá)載體以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻品種日本晴，共獲得186株轉(zhuǎn)基因植株，其中pNAR701的轉(zhuǎn)化植株61株，pNAR702的轉(zhuǎn)化植株12株，pNAR703的轉(zhuǎn)化植株45株，pNAR704轉(zhuǎn)化植株43株，pNAR705的轉(zhuǎn)化植株25株，沒有獲得轉(zhuǎn)pNAR706、 pNAR707和pNAR708的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)PCR、Southern blot分析表明，Pib基因片段已經(jīng)整合到日本晴的基因組中，且全部為單拷貝。T0代種子對潮霉素抗性發(fā)芽試驗發(fā)現(xiàn)，大

6、部分轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出3：1的抗感分離，表明潮霉素基因在轉(zhuǎn)基因后代中是能夠穩(wěn)定遺傳的。Northern blot分析顯示：不同啟動子驅(qū)動下的Pib基因不同片段都能夠在轉(zhuǎn)基因后代中表達(dá)，但mRNA量存在差異.
　　 實時熒光定量分析顯示：Pib基因在pNAR701, pNAR703、pNAR704、pNAR705的Ti代轉(zhuǎn)基因小苗中都有所表達(dá)，701-1單株中mRNA的量最高，705-2的mRNA量最低；并且Pib基因的mRNA量在