水稻Pib啟動子中乙烯和茉莉酸響應元件的轉(zhuǎn)基因分析.pdf

1、植物基因啟動子中包含多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應基因的表達，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心環(huán)節(jié)，也是研究基因的表達調(diào)控機理的重要內(nèi)容。通過制備啟動子的部分序列缺失并將得到的缺失片段與報告基因構建成融合基因，轉(zhuǎn)化后比較轉(zhuǎn)基因植株中報告基因表達狀況來研究啟動子中一些分子元件的功能，是啟動子結構和功能研究的重要方法。
　　 Pib基因是利用圖位克隆技術從水稻中克隆出的第一個抗稻瘟病主效基因，屬于NBS-LRR抗病基因家族，前

2、人研究Pib基因供體品種植株的抗稻瘟性表達受到乙烯、茉莉酸、水楊酸，氯化鈉和黑暗等因素的誘導而不受病原菌接種的誘導。有關水楊酸、氯化鈉和黑暗等誘導因素與Pib啟動子中分子元件的關系已有了轉(zhuǎn)基因分析的報道。乙烯和茉莉酸是植物防御反應的重要信號分子，在植物對生物性和非生物性因素的抗性以及植物生長和發(fā)育過程中的基因調(diào)控上發(fā)揮著重要的作用。然而，Pib基因的乙烯和茉莉酸誘導響應是否是啟動子的響應，以及有關乙烯和茉莉酸誘導因素與啟動區(qū)域內(nèi)分子元件

3、的關系還需要實驗驗證.
　　 為了分析Pib啟動子中應答乙烯和茉莉酸的分子機制，確定乙烯和茉莉酸誘導的必需序列區(qū)域，本文采用了啟動子缺失的方法構建了不同長度的5’端pib基因啟動子驅(qū)動gus基因的雙元載體,通過轉(zhuǎn)基因技術平臺和報告基因體系來研究該pib啟動子中乙烯和茉莉酸誘導響應元件的生物學功能，這將為基因表達調(diào)控的研究及抗病育種提供重要的理論依據(jù)。
　　 1.用PCR法制備了Pib全長啟動子-3572～2bp(3575

4、bp)和3個5＇端缺失片段-2692bp～2bp(2695bp)、-1335bp～2bp(1338bp)、-761bp～2bp(764bp)，得到4個不同長度的Pib啟動子分別置換掉雙元質(zhì)粒pCAMBIA1301中gus基因上游的35S構建為重組質(zhì)粒，構建了pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904四個植物表達載體，重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切鑒定，用農(nóng)桿菌凍融轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株EHA101中。
　　 2.利用農(nóng)桿菌

5、介導法，將pib全長啟動子及其5’端不同缺失體片段驅(qū)動gus基因的四個重組雙元載體pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904和CaMV35S啟動子驅(qū)動gus基因的pCAMBIA1301對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化粳稻R109。經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、潮霉素篩選、分化、壯苗，獲得pNAR901轉(zhuǎn)化植株22株、pNAR902轉(zhuǎn)化植株27株、pNAR903轉(zhuǎn)化植株20株、pNAR904轉(zhuǎn)化植株30株，pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化植株5株，陽性率達

6、到74.8％，對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR， Southern blot和潮霉素抗性鑒定，結果表明目的基因已經(jīng)整合到水稻基因組中，且外源基因大部分以單拷貝插入植物基因組。
　　 3.以Pib全長啟動子及3個5＇端不同長度缺失的Pib啟動子片段驅(qū)動gus基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株為材料，對轉(zhuǎn)基因水稻中GUS活性進行的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的定性和定量分析結果表明，全長Pib啟動子(-3572～2bp，pNAR901)啟動活性最強，茉莉酸或乙

7、烯誘導6h后，其驅(qū)動下的gus基因在轉(zhuǎn)基因植株各部組織中的表達量明顯上升。而-3572～-2692bp區(qū)段序列缺失后不但Pib啟動子啟動活性顯著降低而且也喪失了對茉莉酸和乙烯的誘導活性。pNAR902(-2692～2bp)與pNAR903(-1335～2bp)和pNAR904(-761～2bp)中的Pib啟動子序列的缺失長度相差達2倍和3倍以上，但其對茉莉酸和乙烯的誘導響應沒有區(qū)別。這些結果顯示這三個Pib啟動子缺失體構建中，其共同的缺