轉(zhuǎn)基因煙草中啟動子活性對RNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響.pdf

1、RNA干擾（RNA interference，RNAi）是外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA誘發(fā)地特異性降解與之同源的mRNA，從而導(dǎo)致相應(yīng)基因不表達的現(xiàn)象。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于動物、植物及真菌等生物體中，是生物細胞抵御外來遺傳因子入侵以保持自身基因組完整性的防御機制。對于它的機制，人們從轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄速率等不同角度研究影響RNA沉默的因素。啟動子是一段提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的DNA序列，是基因表達調(diào)控的一種重要的順式元件。為了檢測不同啟動子

2、對RNA介導(dǎo)病毒抗性的影響，本研究選擇了裂葉矮牽牛堿性亮氨酸拉鏈的蛋白質(zhì)（PNZIP）基因啟動子、花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子和玉米泛素蛋白（polyubiquitin）基因Ubi啟動子三種啟動子進行研究，結(jié)果對于將來有效地選擇啟動子成功應(yīng)用RNA介導(dǎo)的病毒抗性策略提供依據(jù)，具有重大指導(dǎo)意義。具體結(jié)果如下：
　　 1、PVYCP基因3’端的400bp和500bp為目的片段，分別插入到雙元表達載體pCAMBIA1300

3、中，構(gòu)建莖長度為400bp，環(huán)長度100bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)植物表達載體p35S+IR、pUbi+IR、pPNZIP+IR.
　　 2、將所構(gòu)建的植物表達載體p35S+IR、pUbi+IR、pPNZIP+IR及空pCAMBIA1300利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。菌液PCR及酶切鑒定證明質(zhì)粒均已成功正確導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。
　　 3、葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。經(jīng)卡那霉素對再生植株進行抗性篩選，后經(jīng)PCR檢測，分別獲得轉(zhuǎn)pCAMB

4、IA1300的煙草30株，轉(zhuǎn)p35S+IR的煙草112株，轉(zhuǎn)pUbi+IR的煙草115株，轉(zhuǎn)pPNZIP+IR的煙草152株。
　　 4、以PVYN的病汁液為接種物，汁液摩擦接種轉(zhuǎn)基因煙草，對轉(zhuǎn)基因植株進行了抗病性分析。癥狀觀察及ELISA檢測表明，不同的轉(zhuǎn)基因植株對PVYN的抗性存在著差異。統(tǒng)計測定結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)pPNZIP+IR、p35S+IR、pUbi+IR的煙草中，PVY抗性植株的比例分別為83.54％、65.18％和2

5、4.33％。
　　 5、轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot及siRNA的雜交分析表明，轉(zhuǎn)基因在RNA水平上都得到了表達，這種抗病性為RNA介導(dǎo)的抗病性，是RNA沉默的結(jié)果，但抗病性與siRNA的積累量二者并無相關(guān)性。
　　 6、啟動子活性檢測通過啟動子驅(qū)動GUS表達載體轉(zhuǎn)化煙草進行GUS活性分析。分別將約1800bp長度的GUS片段連在含有三個啟動子的雙元表達載體之后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)卡那霉素篩選獲得若