產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品科學(xué)與工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目　錄</b></p>

3、;<p><b>　　1 引言3</b></p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p><b>　　2.1 材料3</b></p><p><b>　　2.2 試劑3</b></p><p><b>

4、　　2.2 培養(yǎng)基4</b></p><p>　　2.3 主要儀器與設(shè)備4</p><p>　　2.4 其他器材5</p><p><b>　　2.5 方法5</b></p><p>　　2.5.1 乳桿菌初步篩選5</p><p>　　2.5.2 篩選產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌6&

5、lt;/p><p>　　2.5.3 蛋白酶活力測(cè)定6</p><p>　　2.5.4 計(jì)算8</p><p><b>　　3.結(jié)果與討論8</b></p><p>　　3.1 乳酸菌的篩選8</p><p>　　3.2 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的初篩9</p><p>　　3.

6、3 福林法測(cè)定蛋白酶活力10</p><p>　　3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制10</p><p>　　3.3.2 乳酸菌菌株蛋白酶活力測(cè)定10</p><p><b>　　4 結(jié)論11</b></p><p><b>　　5 展望11</b></p><p>　　致謝

7、錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)12</b></p><p>　　摘要：為獲得具有高產(chǎn)蛋白酶能力的乳酸菌種，本實(shí)驗(yàn)利用MRS培養(yǎng)基、過氧化氫試驗(yàn)和革蘭氏染色試驗(yàn)從牛奶、泡菜、鱸魚腸中分離篩選出乳酸菌，再進(jìn)一步利用酪蛋白培養(yǎng)基與福林法試驗(yàn)篩選出高具有高產(chǎn)蛋白酶能力的乳酸菌菌種。實(shí)驗(yàn)從牛奶、泡菜、鱸魚腸中共分離篩選出17株乳酸菌，經(jīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)篩

8、選出其中具有最強(qiáng)產(chǎn)蛋白酶能力的菌株SA1。它在酪蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)生的溶蛋白圈直徑與酶活力分別為21mm，61.57U/mL。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 乳酸菌;蛋白酶;分離;篩選</p><p>　　Abstract: In order to obtain protease-producing lactobacillus species,,MRS medium, hydrogen per

9、oxide test and Gram stain test were used to isolated lactobacillus form milk、pickles、perch guts, then Medium casein and the Folin method test was used to screene protease-producing good lactobacillus.17 strains lactobaci

10、llus were isolated from milk、pickles、perch guts.Then further experiments isolated the strongest protease production ability strains SA1, which circle diameter of soluble protein on Case</p><p>　　Keywords: La

11、ctobacilli;Protease;Isolated</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB)指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱[1]。目前至少可分為18個(gè)屬，共有200多種[2]。許多乳酸菌是益生菌，是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛

12、存在于人體的腸道中，對(duì)人和動(dòng)物的健康是有益的[3]。乳酸菌的益生作用主要體現(xiàn)在以下六方面[4]：1、排除致病菌、維持宿主腸道菌相平衡。2、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。乳酸菌有利于維他命K、維他命B的吸收，同時(shí)也可促進(jìn)鈣及其它營(yíng)養(yǎng)的消化吸收預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。3、改善乳糖不耐癥。乳酸菌所含的酶系統(tǒng)可彌補(bǔ)乳糖不耐癥患者宿主產(chǎn)生乳糖分解酶不足的缺陷，利用乳酸菌產(chǎn)生的乳糖分解酶活性，將腸內(nèi)乳糖代謝分解。4、減少血液膽固醇堆積。5、抑制癌癥。食用乳酸菌或腸內(nèi)有足夠的乳

13、酸菌存在時(shí)，可減低人類糞便中的某些菌體產(chǎn)生的酥活性如nitroreductase、azoreductase及β-glucuronidase等致癌酶的活性。6、刺激免疫反應(yīng)，增加宿主抵抗能力。乳酸菌細(xì)胞壁含有某些抗原成分可誘發(fā)活化、增加巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞而強(qiáng)化免疫球蛋白A(IgA)的濃度，并產(chǎn)生r-干擾素以刺激宿主</p><p>　　目前關(guān)于乳酸菌的研究報(bào)道雖然已經(jīng)很多[5-7]，但關(guān)于乳酸菌代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道卻

14、很少，其中關(guān)于產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的研究報(bào)道只有寥寥幾篇。現(xiàn)今，由于乳酸菌具有營(yíng)養(yǎng)作用、食療功效、醫(yī)療保健功能和安全性它在現(xiàn)今社會(huì)已得到了廣泛的研究和開發(fā)[8]。乳酸菌蛋白質(zhì)水解能力是影響乳酸菌益生作用的重要因素和開發(fā)含有乳酸菌的乳制品時(shí)，篩選性質(zhì)優(yōu)良，穩(wěn)定性強(qiáng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株的主要指標(biāo)[9]。因此對(duì)它的研究具有十分的必要性和迫切性。</p><p>　　乳酸菌蛋白酶的主要作用[10]：第一，分解蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生多肽、氨基

15、酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳使生成的乳酸，增加胃內(nèi)酸度從而提高胃蛋白酶的活性，利于胃腸道內(nèi)乳酸菌等有益菌的生長(zhǎng)；第三，借助蛋白酶敏感機(jī)制，促進(jìn)損傷的腸黏膜上皮修復(fù)，防止致病菌在腸上皮細(xì)胞間移位。因此，乳酸菌蛋白質(zhì)水解能力是影響乳酸菌開發(fā)利用的重要指標(biāo)。通過對(duì)產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選可以在乳酸菌開發(fā)利用過程中更利于篩選出品質(zhì)優(yōu)良、性質(zhì)穩(wěn)定的乳酸菌菌種；產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選也可以為蛋白酶的生產(chǎn)提供依據(jù)[11]；產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選

16、還可以為飼料的生產(chǎn)提供依據(jù)[12]?？傊a(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選可以為我國(guó)乳酸菌相關(guān)行業(yè)提供有力的支持，會(huì)大大促進(jìn)我國(guó)乳酸菌相關(guān)行業(yè)發(fā)展。</p><p>　　我國(guó)現(xiàn)在正處于經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的黃金時(shí)期，隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的不斷發(fā)展人們對(duì)生活質(zhì)量的要求也在不斷提高。乳酸菌作為一種具有營(yíng)養(yǎng)作用、食療功效、醫(yī)療保健功能和安全性的菌種在未來必定具有廣闊的發(fā)展前景。產(chǎn)蛋白酶能力作為乳酸菌的一項(xiàng)評(píng)判重要指標(biāo)，對(duì)于乳酸菌的選擇和利用具

17、有重要的指導(dǎo)作用。目前，有關(guān)乳酸菌產(chǎn)蛋白酶能力的研究還很少產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選工作還遠(yuǎn)未涉及所有乳酸菌，所以產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選工作還具有十分重要的理論和實(shí)際意義。總之，產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選工作無論在實(shí)際生產(chǎn)還是在理論研究中都具有重大意義，該項(xiàng)工作具有廣闊的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)以泡菜、鯧魚、酸奶為原料通過分離篩選乳酸菌和產(chǎn)蛋白酶能力測(cè)定兩步，從而篩選出其中產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的一株乳酸菌。以期對(duì)乳酸菌產(chǎn)蛋白能力的研究和乳酸菌相關(guān)行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展

18、提供一定的幫助。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p><p>　　泡菜 普通 購(gòu)于寧波大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)</p><p>　　鱸魚

19、 普通 購(gòu)于寧波大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)</p><p>　　美麗健鮮可益生菌酸奶 普通 淮南益益營(yíng)養(yǎng)食品科技有限公司</p><p><b>　　2.2 試劑</b></p><p>　　蒸餾水 二級(jí)

20、 寧波大學(xué)</p><p>　　無水乙醇 分析純 東莞市中冠宏升化工有限公司</p><p>　　溴麝香草酚藍(lán) 分析純 研域(上海)化學(xué)試劑有限公司 </p><p>　　過氧化氫 分析

21、純 上海哈勃化學(xué)技術(shù)有限公司</p><p>　　福林試劑 分析純 上海荔達(dá)生物科技有限公司</p><p>　　酪蛋白 分析純 北京拜爾迪生物技術(shù)公司</p><p>　　碳酸鈉

22、 分析純 上海同森化工有限公司</p><p>　　碘 分析純 明泰國(guó)際石化集團(tuán)華東分公司</p><p>　　結(jié)晶紫 分析純 濰坊浩鑫精細(xì)化工有限公司</p><p>　　草

23、酸銨 分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　番紅 分析純 上海倍翔生物科技有限公司</p><p>　　三氯乙酸 分析純 南通林港化工有限公司</p>

24、<p>　　草酸銨結(jié)晶紫染液：將結(jié)晶紫在研缽中研細(xì)，逐漸加入95%乙醇，繼續(xù)研磨使之溶解，制成A液；將草酸銨溶于蒸餾水中，制成B液。混和A、B，靜置48h，過濾備用。</p><p>　　魯格爾氏碘液：將碘化鉀溶于3-5mL蒸餾水中，然后將碘溶于碘化鉀溶液，再加足水分即成。配成后儲(chǔ)存于棕色瓶中備用，如變?yōu)闇\黃則不可用。</p><p>　　番紅復(fù)染液：2.5 g番紅溶于100 m

25、L95%的乙醇。 </p><p>　　0.4mol/L碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉（Na2CO3）42.4 g，定容至1000 mL。</p><p>　　0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液： 稱取三氯乙酸（CCl3COOH）65.4 g，定容至1000 mL。</p><p>　　2%酪蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取干酪素2 g，稱準(zhǔn)至0.002 g，加入0.1

26、 mol/L氫氧化鈉10 mL，在水浴中加熱使溶解（必要時(shí)用小火加熱煮沸），然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100 mL即成。配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，否則極易繁殖細(xì)菌，引起變質(zhì)。 </p><p>　　100μg/mL酪氨酸溶液：稱取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，逐步加入6 mL 1mol/L的鹽酸使溶解，用0.2 mol/L鹽酸定容至100 mL，其濃度為1000 μg/mL，再

27、吸取濃度為1000 μg/mL的酪氨酸溶液10mL，以0.2 mol/L鹽酸定容至100mL，即配成100 μg/mL的酪氨酸溶液。該溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存,以免繁殖細(xì)菌而變質(zhì)。 </p><p><b>　　2.2 培養(yǎng)基</b></p><p>　　MRS培養(yǎng)基[13] 蛋白胨l0 g，牛肉膏l(xiāng)0 g，酵母浸膏5 g，K2HPO4 2 g，檸檬酸二

28、銨2 g，無水乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgS04·7H2O 0.58 g，MnS04·4H20 0.25 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂20 g，調(diào)pH 6.2—6.4，121℃滅菌20-30 min 。液體MRS培養(yǎng)基不添加瓊脂其他成分同上。 </p>

29、<p>　　酪蛋白培養(yǎng)基[14] 酪蛋白10 g，牛肉膏3 g，磷酸氫二鈉2 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，0.4%溴麝香草酚藍(lán)溶液12.5 mL。將指示劑以外各成分混合，加熱溶解，校正pH，加入指示劑，分裝三角瓶，0.1MPa滅20 min。</p><p>　　保藏培養(yǎng)基 葡萄糖15 g，酵母膏10 g ，CaCO3 15 g ，瓊脂15 g ，蒸餾水1000 mL，pH6.

30、2～6.4</p><p>　　2.3 主要儀器與設(shè)備</p><p>　　電熱恒溫水浴鍋 DK-8D型 上海一恒科技有限公司</p><p>　　烘箱 CS101-1AB 重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司</p><p>　　pH測(cè)量?jī)x

31、 DELTA 320 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p><p>　　分光光度計(jì) T6新銳 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司</p><p>　　分析天平 JD型 余姚市金諾天平儀器有限公司</p&

32、gt;<p>　　電子天平 PL403 余姚市金諾天平儀器有限公司</p><p>　　電腦恒溫層析柜 CXG-1 上海滬西分析儀器廠有限公司</p><p>　　立式高壓滅菌鍋 LDZX-50KB 上海申安醫(yī)療器械廠

33、</p><p>　　實(shí)驗(yàn)室膜分離設(shè)備 LNG-NF-101 上海朗極化工科技有限公司</p><p>　　熱風(fēng)恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG-9108A箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司</p><p>　　玻璃儀器氣流烘干器 C型 鄭州杜甫儀器廠 </p&

34、gt;<p>　　組合式恒溫震蕩培養(yǎng)箱 QHZ-12A 上海滬西分析儀器廠有限公司 </p><p>　　湘儀離心機(jī) HR2500R-2 上?；C(jī)械廠有限公司</p><p><b>　　2.4 其他器材</b></p><p>　　試管、錐

35、形瓶、比色杯、培養(yǎng)皿、試管架、剪刀、移液管、鑷子、塞子、量筒、保鮮膜、洗耳球等。</p><p><b>　　2.5 方法</b></p><p>　　2.5.1 乳桿菌初步篩選</p><p>　　鱸魚前處理[15]：在無菌條件下對(duì)試驗(yàn)用鱸魚進(jìn)行活體解剖，剪下腸道，擠出腸道內(nèi)容物，然后將腸道分成2個(gè)部分，即約4 cm 長(zhǎng)的中腸段和幽門盲囊部。

36、每一部分用無菌注射器將滅菌的生理鹽水溶液注入并沖洗3次，分別放入玻璃勻漿器中，各加1ml滅菌的生理鹽水溶液后勻漿。</p><p>　　分別將寧波大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)所購(gòu)泡菜，經(jīng)前處理得到的鱸魚勻漿，美麗健鮮可益生菌酸奶置于3個(gè)10 ml的燒杯中并標(biāo)號(hào)1、2、3。</p><p>　　樣品稀釋[16]：在超凈工作臺(tái)內(nèi)將樣品1、2、3分別用量程為200 μ L的帶有滅過菌槍頭的移液槍取100 μ L

37、移入到盛有900 μL無菌生理鹽水的離心管中，充分震勻混和均勻，即為10-1的樣品稀釋液。另取100 μL10-1的樣品稀釋液，移入到盛有900 μL的無菌生理鹽水的離心管中，充分震勻混和均勻，即為10-2的樣品稀釋液，反復(fù)上述操作，分別稀釋得到10-1、10-2……10-7、10-8稀釋度。</p><p>　　平板分離培養(yǎng)：將配置好的24個(gè)MRS瓊脂培養(yǎng)基平板底部用記號(hào)筆分別標(biāo)注好樣品種類與稀釋度，每種樣品取

38、10-4到10-8稀釋度進(jìn)行涂布，每個(gè)稀釋度做兩組兩個(gè)做平行試驗(yàn)。涂布實(shí)驗(yàn)時(shí)，用量程為200 μ L的帶有滅過菌槍頭的移液槍取100μ L的樣品稀釋液對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板的中央位置，用無菌玻璃涂布棒，在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，使稀釋液均勻分布于培養(yǎng)及表面，然后在室溫下靜止5-10 min。涂布時(shí)應(yīng)注意，將菌液沿一條直線輕輕來回推動(dòng)，使之分布均勻，然后改變90°沿另一垂直線來回推動(dòng)，平板內(nèi)邊緣處可改變方向有涂布棒在涂布幾次

39、。將涂布好的MRS培養(yǎng)基采用朱缸法培養(yǎng)于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)48 h。</p><p>　　觀察菌落特征、純化培養(yǎng)[17]：待MRS培養(yǎng)基中菌落形成后，挑選白色、圓形、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、凸起的特征菌落，用無菌接種環(huán)劃線接種培養(yǎng)于MRS瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行3次傳代培養(yǎng)。然后，將傳代培養(yǎng)菌種在顯微鏡下觀察是否已經(jīng)完全純化。如果未達(dá)到完全純化則繼續(xù)劃線培養(yǎng)。</p><p>　　H2O2酶試

40、驗(yàn)[18]：將濃度為30%的H2O2稀釋十倍制備3%的過氧化氫溶液。取潔凈的載玻片置于超凈工作臺(tái)中，用無菌吸管吸取一滴濃度為3%的過氧化氫溶液置于載玻片中央，把接種環(huán)在酒精燈火焰上滅菌后，用接種環(huán)挑取一環(huán)純化后的菌落放于3%的過氧化氫溶液中。觀察有無氣泡產(chǎn)生，不產(chǎn)氣泡的為陰性，產(chǎn)生氣泡的為陽性。挑取陰性菌株。</p><p>　　革蘭氏染色[19]：取活躍生長(zhǎng)菌種制片。滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液于涂菌部位，染色1-2

41、 min后傾去染液，水洗至流出水無色，然后用盧氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋涂菌部位1 min，傾去碘液，水洗至流出水無色。用吸水紙吸取玻片上殘留水，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脫色直到流出液無色立即用水洗去乙醇。用吸水紙吸取玻片上殘留水，用番紅復(fù)染液染色2 min，水洗，洗去殘水晾干。在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，紅色為陰性，紫色為陽性。挑選革蘭氏染色陽性菌株為乳酸菌。</p><p>　　2.5.2 篩選產(chǎn)蛋白酶

42、的乳酸菌</p><p>　　乳酸菌增殖培養(yǎng)：配置MRS液體培養(yǎng)基，待MRS液體培養(yǎng)基冷卻后，在超凈工作臺(tái)中用滅菌后的牙簽蘸取實(shí)驗(yàn)分離得到的乳酸菌菌種接種培養(yǎng)于液體MRS培養(yǎng)基中，在搖床中37 ℃條件下，培養(yǎng)24 h。</p><p>　　酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基配置：酪蛋白培養(yǎng)基成分為酪蛋白10 g、牛肉膏3 g、磷酸氫二鈉2 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL、0.4%溴麝香

43、草酚藍(lán)溶液12.5 mL。先將指示劑以外各成分混合，加熱溶解，校正pH，加入指示劑，分裝三角瓶，0.1 MPa滅菌20 min，倒平板。如酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落周圍有透明圈形成，則說明該菌株具有水解酪蛋白的能力。</p><p>　　產(chǎn)蛋白乳酸菌篩選[20]：用量程為200 μL的帶有滅過菌槍頭的移液槍取100μL培養(yǎng)乳酸菌24 h的MRS培養(yǎng)液對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板的中央位置，用無菌玻璃涂布棒，在培養(yǎng)

44、基表面輕輕涂布均勻，使稀釋液均勻分布于培養(yǎng)及表面，然后在室溫下靜止5-10min。將涂布好的酪蛋白瓊脂基倒置培養(yǎng)與37℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h。若菌落周圍有透明圈形成，說明有產(chǎn)蛋白酶能力。透明圈直徑大小與乳酸菌產(chǎn)蛋白酶活力呈正相關(guān)關(guān)系。</p><p>　　2.5.3 蛋白酶活力測(cè)定 </p><p>　　采用SB/T10317-1999福林法[21]測(cè)定乳酸菌的蛋白酶活力。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：按

45、下表1配置不同濃度酪氨酸溶液</p><p>　　表1：酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度</p><p>　　Table 1：The standard concentration of tyrosine</p><p>　　取6支試管標(biāo)號(hào)1-6，分別按下表滴加不同濃度的酪氨酸1 mL，0.4 mol/L的碳酸鈉5 mL，再各加1 mL已稀釋的福林試劑。搖勻置于水浴鍋中，40 ℃保溫

46、發(fā)色20 min用分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品測(cè)三次取平均值。將1-6號(hào)所得吸光值減去1號(hào)所得之即為凈OD值。具體試劑添加情況見表2。</p><p>　　以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，以凈OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　將得到的多種乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)(37 ℃)當(dāng)每種菌株生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)候，離心培養(yǎng)液，取上清進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定。<

47、;/p><p>　　稀釋酶液：將離心后的上清液用pH值為6.8的酸性緩沖液稀釋50倍。</p><p>　　樣品測(cè)定：取三支試管編號(hào)1、2、3，每個(gè)試管加稀釋液1 mL，置于40 ℃條件下水浴2 min，然后加經(jīng)相同預(yù)熱條件處理的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min。然后再各加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，繼續(xù) </p><

48、p>　　保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后過濾。另取三支試管編號(hào)1、2、3，各加入濾液1 mL，0.4 mol/L的碳酸鈉5 mL，已稀釋福林試劑1 mL，搖勻，保溫發(fā)色20 min后測(cè)OD值。</p><p>　　表2：標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑添加表格</p><p>　　Table 2：Measurement the OD of standard curve</p><

49、p>　　空白試驗(yàn)測(cè)定方法同上，只是在加酪蛋白前加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加酪蛋白。具體見表3、表4.</p><p>　　表3：實(shí)驗(yàn)組與空白組試劑添加情況</p><p>　　Table 3：The reagents added conditions of experimental group and control group </p><

50、;p><b>　　表4：測(cè)量OD值</b></p><p>　　Table 4：Measure OD values ?</p><p><b>　　2.5.4 計(jì)算</b></p><p>　　在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。 </p><p>　　樣品蛋

51、白酶活力單位(干基)=?OD*K*4/10*N</p><p>　　式中：?OD——凈OD值；</p><p>　　K——凈OD值為1時(shí)，酪氨酸濃度；</p><p>　　4——4毫升反應(yīng)液取出1 mL測(cè)定 (即4倍)； </p><p>　　N——酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　10——反應(yīng)10min。<

52、/p><p><b>　　3.結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 乳酸菌的篩選</p><p>　　通過菌落特征、細(xì)菌形態(tài)特征、H2O2酶試驗(yàn)、革蘭氏染色試驗(yàn)的篩選，從泡菜、鱸魚、美麗健鮮可益生菌酸奶中共篩選分離得到了17株乳酸菌，其中大部分乳酸菌為短桿菌，還有少數(shù)桿菌和鏈球菌具體情況見表5、6、7。</p><p&

53、gt;　　表5：泡菜中分離篩選乳酸菌</p><p>　　Table 5：Isolated lactic acid bacteria form Kimchi</p><p>　　表6：鱸魚中分離篩選乳酸菌</p><p>　　Table 6：Isolated lactic acid bacteria form perch intestinal</p>

54、<p>　　表7：美麗健鮮可益生菌酸奶中分離篩選乳酸菌</p><p>　　Table 7：Isolated lactic acid bacteria form probiotic yogurt</p><p>　　3.2 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的初篩</p><p>　　將分離篩選所的乳酸菌涂布于酪蛋白培養(yǎng)基上在恒溫箱中37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。酪蛋白培養(yǎng)基培

55、養(yǎng)篩選結(jié)果顯示，共有十株乳酸菌可產(chǎn)生明顯溶蛋白圈。它們標(biāo)號(hào)分別為SA1、SA2、SA5、SA6、SB1、SB3、SB5、SB6、SC1、SC2。其中泡菜中分離得到的乳酸菌SA1產(chǎn)生的溶蛋白圈直徑最大（21mm）。具體溶蛋白圈直徑見表8。</p><p>　　酪蛋白培養(yǎng)基初選產(chǎn)蛋白酶乳酸菌時(shí)注意：在培養(yǎng)過程中，酪蛋白瓊脂平板培養(yǎng)基在培養(yǎng)乳酸菌之前都是透明的，當(dāng)培養(yǎng)乳酸菌一段時(shí)間后，培養(yǎng)基變?yōu)槿榘咨?，這說明乳酸菌所產(chǎn)

56、生的乳酸將培養(yǎng)基中的酪蛋白變性，導(dǎo)致培養(yǎng)乳酸菌后平板培養(yǎng)基呈現(xiàn)乳白色。若某乳酸菌產(chǎn)生蛋白酶，則蛋白酶會(huì)將此乳酸菌周圍的酪蛋白水解，導(dǎo)致其周圍有透明圈的出現(xiàn)，從而初步篩選出產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌種。初篩結(jié)果顯示，十七株乳酸菌中有10菌乳酸菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力，其中產(chǎn)蛋白酶能力從強(qiáng)到弱依次為：SA1、SA2、SB1、SA6、SB3、SC2、SA5、SB5、SC1、SB6。</p><p>　　表8：乳酸菌產(chǎn)生的溶蛋白圈

57、直徑</p><p>　　Table 8：Circle diameter of soluble protein</p><p>　　3.3 福林法測(cè)定蛋白酶活力</p><p>　　3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制</p><p>　　測(cè)定不同濃度條件下1mL酪氨酸溶液，在添加0.4 mol/L的碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻置于水浴

58、鍋中，40 ℃保溫發(fā)色20 min處理后在660 nm條件下的OD值。根據(jù)測(cè)得的OD值，以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得OD值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量OD值見表9，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。 </p><p>　　表9：不同濃度酪氨酸溶液OD值</p><p>　　Table 9：The OD values of different concentrations of tyrosine solutio

59、n</p><p>　　圖1：酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Figure 1: Tyrosine solution in the 660nm absorbance of the standard curve office</p><p>　　3.3.2 乳酸菌菌株蛋白酶活力測(cè)定 </p><p>　　根據(jù)各乳酸菌菌種在酪蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)生

60、溶蛋白圈直徑的情況，進(jìn)一步對(duì)菌株SA1、SA2、SA5、SA6、SB1、SB3、SB5、SB6、SC1、SC2的蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定。具體測(cè)定值見表十。</p><p>　　表10：乳酸菌酶活力測(cè)定值</p><p>　　Table 10：Activity of lactic acid bacteria</p><p>　　蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果與產(chǎn)蛋白酶乳酸菌初篩結(jié)果相

61、符，標(biāo)號(hào)為SA1的乳酸菌具有最大的酶活力。將SA1菌種保存以備研究和應(yīng)用。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)乳酸菌的來源為泡菜、美麗健鮮可益生菌酸奶、鱸魚腸，而以前產(chǎn)蛋白酶乳酸菌篩選相關(guān)實(shí)驗(yàn)的菌種來源一般為一種原料或?qū)嶒?yàn)室保存乳酸菌。童敏，潘道東[17]2010年發(fā)表的鴨腸內(nèi)產(chǎn)蛋白酶乳酸桿菌的分離篩選乳酸菌來源只有鴨腸。陳超，高學(xué)軍，劉 營(yíng)[22]等2008年發(fā)表的產(chǎn)蛋白酶乳酸茵的篩選及蛋白酶的純化乳酸菌菌種來源是實(shí)驗(yàn)

62、室保存的21株乳酸菌。因此，本實(shí)驗(yàn)乳酸菌菌種的來源更為廣泛，篩選出來的產(chǎn)蛋白酶乳酸菌較以往實(shí)驗(yàn)相比較更具有代表性。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)篩選出來的乳酸菌酶活力為61.57U/ml,與以往實(shí)驗(yàn)篩選出來的乳酸菌相比該株乳酸菌也均有較高的酶活力。所以，本實(shí)驗(yàn)篩選所得乳酸菌具有一定理論和實(shí)際意義。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　泡菜、美麗健鮮可益生菌酸

63、奶、鱸魚腸道中都含有乳酸菌，其中從泡菜、美麗健鮮可益生菌酸奶、鱸魚腸道內(nèi)分別篩選出6、7、4株乳酸菌。篩選得到的乳酸菌以短桿入為主還有少數(shù)桿菌和鏈球菌。</p><p>　　酪蛋白培養(yǎng)基和福林法都可以篩選出產(chǎn)蛋白酶乳酸菌，但酪蛋白培養(yǎng)基中產(chǎn)生的溶蛋白圈直徑與福林法所測(cè)的OD值之間并不呈線性關(guān)系。</p><p>　　通過實(shí)驗(yàn)篩選出泡菜中的SA1菌株具有最強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力，它在酪蛋白培養(yǎng)基上

64、可以產(chǎn)生最大的溶蛋白圈直徑（21mm），同時(shí)它在福林法試驗(yàn)中測(cè)得具有最強(qiáng)的酶活力61.57 U/mL。</p><p><b>　　5 展望</b></p><p>　　乳酸菌作為一種具有營(yíng)養(yǎng)作用、食療功效、醫(yī)療保健功能和安全性的菌種在在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)以及食品工業(yè)等方面發(fā)揮越來越重要的作用。乳酸菌蛋白酶可以分解蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生多肽、氨基酸；分解牛乳生成的乳酸，增加胃內(nèi)

65、酸度提高胃蛋白酶的活性；促進(jìn)損傷的腸黏膜上皮修復(fù)，防止致病菌在腸上皮細(xì)胞間移位。因此，乳酸菌蛋白質(zhì)水解能力是影響乳酸菌益生作用的重要因素和開發(fā)含有乳酸菌的乳制品時(shí)，篩選性質(zhì)優(yōu)良，穩(wěn)定性強(qiáng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株的重要指標(biāo)。而目前，有關(guān)乳酸菌產(chǎn)蛋白酶能力的研究還很少產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選工作還遠(yuǎn)未涉及所有乳酸菌，所以產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選工作還具有十分重要的理論和實(shí)際意義，具有廣闊的發(fā)展前景。</p><p><b>

66、　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 孟祥晨,杜鵬, 李艾黎等.乳酸菌與乳品發(fā)酵劑[M].北京:科學(xué)出版社,2009:1-2.</p><p>　　[2] Christensen JE, Dudley EG,Peferson JA. Peptidases and amino acid catabolish in lactic bacteria[J]. Anonie

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