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1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文低溫脅迫下番茄紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的表達和功能研究姓名:韓菡申請學(xué)位級別:博士專業(yè):植物學(xué)指導(dǎo)教師:孟慶偉20090601低溫脅迫下番茄紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的表達和功能研究集區(qū),有活性的VDE中N一端含有1113個半胱氨酸,是VDE的抑制劑DTT作用的區(qū)域,低濃度DTT只能部分抑制VDE的活性,說明N端的半胱氨酸形成不止一個二硫鍵。blockII為脂質(zhì)運載蛋白特征區(qū),結(jié)合和轉(zhuǎn)運疏水小分子的區(qū)域,為疏水底物A和Z的
2、結(jié)合區(qū)。blockIII是C端谷氨酸富集區(qū),含有大量的負電荷,是VDE與類囊體膜結(jié)合的部位。2Northern雜交結(jié)果表明,LeVDE基因呈非特異性表達,在葉綠素含量高的組織中表達量較高。同時,該基因在弱光和強光處理的24小時晝夜周期中都存在著相似的雙峰表達模式,并部分受低溫的抑制。Southern雜交結(jié)果表明,LeVDE基因在番茄基因組中是單拷貝的。3將獲得的LeVDE基因與含有35S啟動子的pBll21載體重組,分別構(gòu)建了正義和反義
3、表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄,用PCR及Northern雜交的方法對帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進一步檢測,結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的番茄植株。與野生型植株相比,過量表達LeVDE基因的番茄葉片中A和z的含量增加,而V的含量減少,脫環(huán)氧化狀態(tài)較野生型高。LeVDE基因表達受到抑制的番茄植株中V量積累,而A和Z含量非常低,脫壞氧化狀態(tài)保持較低的水平4構(gòu)建了原核表達載體pETLeVDE,并在大腸桿菌BL21中表達融合蛋
4、白,將強誘導(dǎo)帶切下,溶于PBS獲得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效價為1:500。Western雜交表明,轉(zhuǎn)正義植株中LeVDE基因已在蛋白水平過量表達。另外,分別對低溫弱光和強光處理的野生型番茄進行了Western雜交分析。結(jié)果表明,LeVDE在蛋白水平的表達始終處在穩(wěn)定的水平,基本不受光強和溫度的影響。5在低溫弱光(4℃,100gmolm之S‘1)和強光(1200gmolm~s。)脅迫條件下,野生型和轉(zhuǎn)正義基因株系Tl一7和Tl—lO株
5、系的NPQ及葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化狀態(tài)(AZ)/(VAZ)都增加,但野生型的增加更為明顯。在低溫弱光及強光脅迫條件下,依賴葉黃素循環(huán)的NPQ能夠耗散過剩激發(fā)能,而轉(zhuǎn)基因株系比野生型耗散能力加強。強光處理過程中,野生型比轉(zhuǎn)正義基因株系的Fv/Fm降低更明顯,且轉(zhuǎn)基因株系的Fv/Fm恢復(fù)較快,野生型的Fv/Fm恢復(fù)較慢。與在強光下類似,Tl一7和T110株系的Fv/Fm在低溫脅迫過程中降低的程度比野生型小,而恢復(fù)較慢。這表明LeVDE的過量表達
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