番茄脂肪氧化酶基因TomloxD的畢赤酵母表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、植物脂肪氧化酶(LOX)是一類由單一的多肽鏈組成的含有非血紅素鐵、不含硫的過氧化物酶，它催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的雙加氧反應(yīng)，如亞油酸（linoleic acid，LA）、亞麻酸(α-linolenic acid，LeA)、花生四烯酸（arachidonic acid，AA）。LOX參與了植物的傷害反應(yīng)、病原攻擊、種子萌芽、果實(shí)熟化、植物衰老以及脫落酸(Abscisic acid，ABA)和茉莉酸(Jasmo

2、nic acid，JA)合成等生理生化反應(yīng)。
　　 番茄中有五個(gè)LOX同工酶基因，即TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD、TomloxE。TomloxA、TomloxB和TomloxE相互之間的氨基酸序列的一致性是72％-77％，而TomloxC和TomloxD與TomloxA蛋白的一致性分別是42％和47％，TomloxC與TomloxD的蛋白的氨基酸一致性是46％。TomloxA、TomloxB和T

3、omloxE在果實(shí)中表達(dá)；TomloxC在成熟果實(shí)的轉(zhuǎn)色期和紅熟期可以檢測到，在葉片和花器中也有表達(dá)；而TomloxD主要在番茄葉中表達(dá)。乙烯能增強(qiáng)TomloxB和TomloxC的表達(dá)，而TomloxA的表達(dá)降低。其中TomloxC和TomloxD具有葉綠體導(dǎo)向信號，定位于葉綠體。這些結(jié)果表明不同的LOX異構(gòu)體受到不同的調(diào)節(jié)，在番茄的生長發(fā)育過程中有不同的功能。到目前為止，番茄TomloxD基因的功能尚不清楚，為進(jìn)一步闡明TomloxD

4、基因在植物抗病性、抗逆性中的作用，本研究的主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　 1．從質(zhì)粒pBluescript TomloxD上PCR擴(kuò)增TomloxD全長基因序列，利用pDH5.1質(zhì)粒的35S CaMV啟動(dòng)子和終止子，構(gòu)建了超表達(dá)載體pBINl9-TomloxD；通過序列比對擴(kuò)增同源性較高的290 bpTomloxD基因片段序列，利用pDHG5.2中間載體構(gòu)建TomloxD基因RNAi載體pBINl9-TomloxDi。
　　

5、 2．分別將雙元載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LB4404，以AC++番茄子葉為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將目的基因轉(zhuǎn)入番茄，經(jīng)過50 mg/L Kan及500 mg/L的Sm篩選，獲得一部分生根的再生植株，通過PCR檢測表達(dá)載體上特有的NPTⅡ基因篩選到陽性植株。
　　 3．以番茄Actin基因?yàn)閮?nèi)參，通過半定量RT-PCR，研究TomloxD基因在番茄不同組織的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因在根、成熟葉片，幼葉中表達(dá)，在果實(shí)中表達(dá)量很低。機(jī)械