番茄GA20-氧化酶和GA2-氧化酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、赤霉素(GA)是一類重要的植物激素，具生物活性的 GA 作用于高等植物的整個(gè)生命周期。包括種子萌發(fā)、莖和根的伸長(zhǎng)、葉片伸展、表皮毛發(fā)育、花粉管伸長(zhǎng)、花和果實(shí)的發(fā)育等。而且植物也通過調(diào)節(jié)內(nèi)源赤霉素的生物合成來介導(dǎo)自身對(duì)環(huán)境因子的應(yīng)答。因此，赤霉素生物合成的調(diào)控對(duì)植物的發(fā)育及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)有著極為重要的意義。以前在農(nóng)業(yè)或園藝學(xué)上對(duì)植株的調(diào)控主要是采用一些化學(xué)的方法。在了解了GA生物合成途徑的基礎(chǔ)上就可以利用生物技術(shù)從基因水平上對(duì)植株特定組織

2、的特定基因進(jìn)行調(diào)控來控制植株的生長(zhǎng)。 目前赤霉素生物合成途徑中大部分的關(guān)鍵酶基因已經(jīng)被克隆，這些基因的克隆為我們探討 GA 在植物根、莖、葉、花和果實(shí)的發(fā)育過程中的作用機(jī)理創(chuàng)造了條件。GA 20-氧化酶和GA 2-氧化酶是赤霉素合成代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，都由多基因家族編碼，GA 20-氧化酶促進(jìn)活性GA的合成而GA 2-氧化酶將活性的GA轉(zhuǎn)化為非活性GA。對(duì)GA 20-氧化酶和GA 2-氧化酶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，將影響活性GA

3、的合成代謝，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。目前，番茄的GA 2-氧化酶基因還沒有被克隆。對(duì) GA 20-氧化酶基因家族各個(gè)成員分別在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能的研究也沒有報(bào)道。番茄是研究植物生長(zhǎng)發(fā)育比較好的模式植物，以番茄為材料研究GA2-oxidase和GA 20-oxidase基因家族不同成員的生物學(xué)功能，對(duì)全面了解赤霉素在植物根、莖、葉、花、果等的生長(zhǎng)、發(fā)育以及形態(tài)建成過程中所發(fā)揮的作用，闡明其作用的可能的分子機(jī)理有著重要的理論意義。同時(shí)對(duì)番

4、茄生產(chǎn)中合理利用赤霉素來調(diào)控番茄植株的生長(zhǎng)發(fā)育也具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。 本研究以番茄這一重要的蔬菜作物為材料，克隆了編碼番茄 GA20-氧化酶的 3個(gè)家族成員，利用RNA干涉技術(shù)分別調(diào)控3個(gè)基因的表達(dá)，從分子水平，植株表型以及組織顯微結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)測(cè)定等方面進(jìn)行分析，初步確定了3個(gè)GA 20-氧化酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的主要功能；克隆和鑒定番茄GA 2-oxidase2全長(zhǎng)基因，分析了其序列特征。構(gòu)建了干涉表達(dá)載體，從分子水平

5、進(jìn)行分析闡明了該基因可能的作用機(jī)理。本研究獲得的主要結(jié)果如下： 1.克隆了番茄赤霉素生物合成途徑中的GA 2-氧化酶2(GA2ox2)基因的全長(zhǎng)cDNA。其GenBank登錄號(hào)為EF017805，測(cè)序結(jié)果表明該cDNA全長(zhǎng)1203 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)為969 bp的完整開放讀碼框，編碼322個(gè)氨基酸。 2.對(duì)3個(gè)GA 20-oxidase和GA 2-oxidase2基因在番茄不同組織器官中的表達(dá)進(jìn)行了半定量 RT-PCR

6、分析，結(jié)果表明這兩個(gè)基因在番茄根、莖、葉、花、果實(shí)等各種組織器官中呈組成型表達(dá)，但不同組織的表達(dá)水平有差異。 3.構(gòu)建了GA 20-oxidasc和GA 2-oxidase2基因的RNAi表達(dá)載體共4個(gè)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將 RNAi 表達(dá)載體導(dǎo)入常規(guī)番茄品種中蔬五號(hào)中，共獲得卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化植株85棵。PCR檢測(cè)和Southern雜交結(jié)果表明，外源基因已經(jīng)整合到番茄基因組中，其拷貝數(shù)1-6個(gè)不等。 4.對(duì)RN

7、Ai轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果顯示，靶基因在相應(yīng)RNAi轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官中的表達(dá)量有不同程度的降低，單個(gè)GA 20-oxidase基因家族成員的表達(dá)受抑制時(shí)其它成員的表達(dá)不受影響。說明RNAi能特異有效的抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。 5.采用 ELISA 對(duì) RNAi 轉(zhuǎn)基因植株的赤霉素含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明：抑制GA20ox1和 GA20ox2基因的表達(dá)顯著降低植物體內(nèi) GA的合成；抑制GA2

8、0ox3基因的表達(dá)對(duì)GA的合成影響較小。GA 2-oxidase2基因的抑制對(duì)植物GA的合成沒有影響。 6.對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了表型的觀測(cè)和相關(guān)形態(tài)指標(biāo)以及生理指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明：GA20ox1和GA20ox2 RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)半矮化，葉片變小增厚，葉色加深；葉綠素含量增加，光合效率增強(qiáng)。GA20ox3 RNAi轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根數(shù)量減少，長(zhǎng)度略增加。3個(gè)GA20ox的 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株均能正常開花結(jié)果，形成正常的種子。說

9、明抑制 GA20ox的表達(dá)對(duì)植物營養(yǎng)器官的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，而對(duì)生殖器官的發(fā)育影響不大。 7.有些植物赤霉素嚴(yán)謹(jǐn)型突變體種子敗育，種子發(fā)芽率降低。對(duì)3個(gè)GA 20-oxidaseRNAi轉(zhuǎn)基因植株的種子進(jìn)行了發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，抑制GA20ox的表達(dá)影響種子萌發(fā)，種子萌發(fā)率降低，萌發(fā)時(shí)間推遲。 8.轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)半矮化，葉片變小增厚。莖和葉的組織顯微結(jié)構(gòu)顯示：GA20ox1和GA20ox2 RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片葉肉細(xì)胞

10、增大，柵欄組織發(fā)達(dá)，排列緊密，葉厚度顯著增加；莖的木質(zhì)部厚度減小。GA20ox3 RNAi轉(zhuǎn)基因植株莖和葉的顯微結(jié)構(gòu)與對(duì)照相似。說明GA20ox1、GA20ox2的抑制表達(dá)影響了莖和葉中不同組織細(xì)胞的分裂和形成，GA20ox3的抑制對(duì)莖、葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響不大。 9.植株矮化，葉片增厚是植物抗逆性提高的兩個(gè)表觀特征。對(duì)GA20-oxidase RNAi轉(zhuǎn)基因植株后代的抗旱特性進(jìn)行了初步觀測(cè)，結(jié)果表明抑制GA20ox1和GA20ox2