低溫脅迫下番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的表達(dá)和功能研究.pdf

1、當(dāng)植物吸收了過(guò)多的光能,而不能被光合電子傳遞途徑有效利用時(shí),過(guò)剩光能就會(huì)降低光合效率從而導(dǎo)致光抑制,甚至光氧化破壞。除了在強(qiáng)光條件下會(huì)發(fā)生光抑制,在低溫弱光等逆境條件下植物由于碳同化能力降低對(duì)光能的利用減少,也會(huì)產(chǎn)生過(guò)剩光能從而導(dǎo)致光抑制。為了避免或減少光抑制,高等植物體內(nèi)存在著多種防御機(jī)制,其中葉黃素循環(huán)被認(rèn)為是在環(huán)境脅迫下保護(hù)植物光合機(jī)構(gòu)免受過(guò)剩光能破壞的一種重要的機(jī)制。葉黃素循環(huán)是指植物吸收的光能過(guò)剩時(shí),雙環(huán)氧的紫黃質(zhì)(V)在紫黃

2、質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)的催化下,經(jīng)過(guò)中間物單環(huán)氧的花藥黃質(zhì)(A)轉(zhuǎn)化為無(wú)環(huán)氧的玉米黃質(zhì)(Z);在暗處,則在玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZE)的作用下朝相反的方向進(jìn)行,將Z重新環(huán)氧化為V,形成一個(gè)循環(huán)。依賴于葉黃素循環(huán)的非光化學(xué)猝滅(NPQ)能夠保護(hù)植物光合機(jī)構(gòu)免受過(guò)剩激發(fā)能的破壞。有過(guò)剩光能存在時(shí),由紫黃質(zhì)(V)脫環(huán)氧化而積累的玉米黃質(zhì)(Z)也被人們普遍認(rèn)為對(duì)光合機(jī)構(gòu)起到至關(guān)重要的保護(hù)作用。 本研究從番茄葉片中分離到番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基

3、因,并對(duì)該基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,該基因的表達(dá)并不受光強(qiáng)和溫度的誘導(dǎo),而受晝夜節(jié)律的影響。過(guò)量表達(dá)該基因可增強(qiáng)番茄植株對(duì)光抑制的敏感性,而抑制該基因表達(dá)可減輕番茄植株在低溫弱光脅迫下的光抑制程度,影響番茄花的顏色。主要結(jié)果如下： 1.利用同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,通過(guò)RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的中間片段,通過(guò)5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’和3’片段,拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長(zhǎng)

4、cDNA。命名為L(zhǎng)eZE(EF581828)。該基因全長(zhǎng)為2437bp,ORF為2010bp,編碼669個(gè)氨基酸,分子量約為73 kDa。同源序列比較發(fā)現(xiàn),番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的序列與馬鈴薯、煙草、胡蘿卜、葡萄的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的序列同源性較高。結(jié)構(gòu)同源性分析表明LeZE有四個(gè)序列保守的結(jié)構(gòu)域,block I和block II為脂質(zhì)蛋白運(yùn)載家族的特征區(qū)域,block Ⅲ是黃素蛋白單加氧酶區(qū)域以及block IV的FHA結(jié)合區(qū)域,

5、它們組成了一個(gè)重要的催化位點(diǎn)。 2.Northern雜交結(jié)果表明,LeZE基因在番茄不同器官中呈非特異性表達(dá),在葉綠素含量高的組織中表達(dá)量較高。同時(shí),該基因在低溫弱光和強(qiáng)光處理的24小時(shí)晝夜循環(huán)中都存在著相似的晝夜節(jié)律的表達(dá)模式,并不受溫度和光強(qiáng)的影響。Southern雜交結(jié)果表明,LeZE基因在番茄基因組中是單拷貝的。 3.將獲得的LeZE基因與含有35S啟動(dòng)子的pBI121載體重組,分別構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體,利用

6、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄,用PCR及Northern雜交的方法對(duì)帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)一步檢測(cè),結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的番茄植株。與野生型植株相比,過(guò)量表達(dá)LeZE基因的番茄葉片中A和z的含量降低,而V的含量增加,脫環(huán)氧化狀態(tài)較野生型低。LeZE基因表達(dá)發(fā)生沉默的番茄植株中Z大量積累,而A和V的含量非常低,脫環(huán)氧化狀態(tài)保持非常高的水平。 4.構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-LeZE,并在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合

7、蛋白,將強(qiáng)誘導(dǎo)帶切下,溶于PBS獲得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效價(jià)為1:500。Western雜交表明,轉(zhuǎn)正義植株中LeZE基因已在蛋白水平過(guò)量表達(dá)。另外分別對(duì)低溫弱光和強(qiáng)光處理的野生型番茄進(jìn)行了Western雜交分析。結(jié)果表明,LeZE在蛋白水平的表達(dá)始終處在穩(wěn)定的水平,基本不受光強(qiáng)和溫度的影響。 5.在低溫弱光(4℃,100 μmol m-2 s-1)和強(qiáng)光(1200 μmol m-2s-1)脅迫條件下,野生型和轉(zhuǎn)正義基因株

8、系T1-1和T1-10株系的NPQ及葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化狀態(tài)(A+Z)/(V+A+Z)都增加,但野生型的增加更為明顯。在低溫弱光及強(qiáng)光脅迫條件下,依賴葉黃素循環(huán)的NPQ能夠耗散過(guò)剩激發(fā)能,而轉(zhuǎn)基因株系比野生型耗散能力下降。強(qiáng)光處理過(guò)程中,與野生型相比轉(zhuǎn)正義基因株系的Fv/Fm降低更明顯,且野生型的Fv/Fm恢復(fù)較快,轉(zhuǎn)基因株系的Fv/Fm恢復(fù)較慢,野生型番茄的Fv/Fm可以在24 h內(nèi)恢復(fù),而T1-1和T1-10株系的Fv/Fm在24 h

9、時(shí)分別恢復(fù)了93.7％和94.1％。與在強(qiáng)光下類似,T1-1和T1-10株系的Fv/Fm在低溫脅迫過(guò)程中降低的程度比野生型大,而恢復(fù)較慢,恢復(fù)12h時(shí)野生型的Fv/Fm完全恢復(fù),但轉(zhuǎn)基因株系24h才完全恢復(fù)。這表明LeZE的過(guò)量表達(dá)加重了PSII的光抑制程度,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因番茄的PSII反應(yīng)中心受傷害較嚴(yán)重。強(qiáng)光脅迫6h和12h,野生型和轉(zhuǎn)基因番茄的放氧速率降低非常顯著,低溫弱光處理6h和12h,野生型和轉(zhuǎn)基因番茄的放氧速率也都降

10、低,但下降程度不如強(qiáng)光處理下的明顯。這表明由于LeZE的過(guò)量表達(dá)降低了低溫弱光和強(qiáng)光脅迫下放氧復(fù)合體的穩(wěn)定性,使光合機(jī)構(gòu)所受到的傷害加重。在低溫弱光處理過(guò)程中轉(zhuǎn)正義基因植株與野生型的氧化態(tài)P700都降低,且區(qū)別不大。經(jīng)過(guò)12h的處理,T1-1,T1-10和野生型的O2-含量分別增加了82.1％,76.8％和66.5％,H2O2含量分別增加了93.4％,87.8％和80.3％。轉(zhuǎn)基因株系中O2-和H2O2含量增加的程度明顯高于野生型。另外

11、,在低溫處理過(guò)程中,轉(zhuǎn)正義基因植株和野生型的MDA含量都增加,但轉(zhuǎn)正義基因植株的MDA含量增加的較多。 6.在田間生長(zhǎng)的番茄野生型和轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期強(qiáng)光適應(yīng),它們的放氧和葉綠素a/b比在弱光下生長(zhǎng)的野生型和轉(zhuǎn)基因植株高,而總?cè)~綠素含量比弱光下低。轉(zhuǎn)正義基因與野生型之間的差別不大。這些結(jié)果表明,在強(qiáng)光下生長(zhǎng)的番茄植株比弱光下生長(zhǎng)番茄植株有更強(qiáng)的光合能力和較小的捕光天線,以適應(yīng)強(qiáng)光條件。在夏季正午1980 μmolm-2 s-1的

12、光下,野生型和轉(zhuǎn)正義基因植株的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和實(shí)際光化學(xué)效率(φPSII)沒有差別。兩個(gè)轉(zhuǎn)正義基因株系的脫環(huán)氧化狀態(tài)均低于野生型植株,但是與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系有較高的總抗壞血酸含量。另外轉(zhuǎn)基因株系中SOD的活性也要高于野生型。APX的活性在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中基本沒有差異。 7.抑制LeZE的表達(dá)不影響過(guò)剩光能脅迫下的NPQ。在轉(zhuǎn)反義基因植株中Z大量積累而V和A的含量非常低。在強(qiáng)光和低溫弱光脅迫后,轉(zhuǎn)反義基因植

13、株脫環(huán)氧化狀態(tài)始終保持很高的水平。在強(qiáng)光和低溫脅迫過(guò)程中野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的NPQ都上升,但兩者的NPQ基本沒有差別。這表明Z在PSⅡ熱耗散中可能不起決定性的作用。 8.在強(qiáng)光脅迫下野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的放氧速率和Fv/Fm都降低,但是野生型與轉(zhuǎn)反義基因植株間沒有差別。在低溫弱光脅迫12h后野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的放氧速率都降低,但野生型降低的更為明顯。12h脅迫后野生型,(-)1和(-)5植株的放氧速率分別下降到原來(lái)的4

14、2.3％,60.8％和58.7％。低溫弱光脅迫下野生型與轉(zhuǎn)反義基因植株的Fv/Fm均下降野生型下降更為明顯。低溫脅迫12h后野生型,(-)1和(-)5的放氧速率分別下降了10.5％,7.1％和7.9％。在低溫弱光處理過(guò)程中轉(zhuǎn)反義基因植株與野生型的氧化態(tài)P700都降低,野生型植株P(guān)700的下降更為顯著。 野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的SOD和APX活性在低溫弱光處理前6個(gè)小時(shí)內(nèi)先有所上升,之后開始下降,野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株間酶活性差別

15、不大。但是野生型植株中O-2和H2O2含量明顯高于轉(zhuǎn)反基因株系。低溫處理后,(-)1,(-)5和野生型植株中O-2含量分別增加了37.6％,42.5％和82.7％,H2O2含量分別增加了39.5％,37.9％和84.8％。經(jīng)低溫弱光處理后,野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株中MDA含量都增加,野生型中MDA含量增加更為顯著,低溫脅迫12小時(shí)后野生型,(-)1和(-)5中MDA含量分別增加到131.5％,110.8％和115.7％。另外轉(zhuǎn)反義基因植株