層孔菌乙酸乙酯提取物的分離和純化　　 　　【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　層孔菌乙酸乙酯提取物的分離和純化　　 　　</p><p>　　所在學院 </p>

2、<p>　　專業(yè)班級 化學工程與工藝 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘

3、要: 本文以松針層孔菌乙酸乙酯提取物為起始原料，以硅膠柱作為分離柱，通過用乙酸乙酯、石油醚、甲醛，分離松針層孔菌乙酸乙酯提取物，通過氣質聯(lián)應用儀進行研究。</p><p>　　本文利用1氣質聯(lián)應用儀對產物進行了結構分析及表征，并研究了提取物的組成，得到最后物質。</p><p>　　關鍵詞: 松針層孔菌；乙酸乙酯；分離</p><p>　　Abstract: Ta

4、king pine layer hole bacteria acetic ester extract as the starting material, with silica column as separation column, through using ethyl acetate, petroleum ether, formaldehyde, separate pine layer hole bacteria acetic e

5、ster extract, through the temperament. Al application instrument</p><p>　　This paper use 1 temperament league application apparatus on product for structure analysis and characterization, and studied the com

6、position, get last extract substan. </p><p>　　Keywords: Pine layer hole bacteria ; Ethyl acetate; separation目 錄</p&

7、gt;<p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 選題的背景、意義1</p><p>　　1.2 國內外研究動態(tài)4</p><p>&l

8、t;b>　　2 實驗部分4</b></p><p>　　2.1.1 試劑4</p><p>　　2.1.2 儀器6</p><p>　　2.2.1 硅膠柱簡介8</p><p>　　2.2.2 濕法分離10</p><p>　　2.3 分離路線設計10</p>&

9、lt;p>　　3 結果與討論11</p><p><b>　　4 結論15</b></p><p><b>　　致謝16</b></p><p><b>　　參考文獻17</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p

10、><p>　　1.1 選題的背景、意義</p><p>　　隨著經濟的發(fā)展，生活條件越來越優(yōu)越，身體健康和保健因此引起了人們的高度關注。蘑菇是營養(yǎng)功能性食品，也是為生理方面的有利醫(yī)藥的重要資源。他們生產出許多有趣生物活動的次生代謝產物，從而才有潛力用于藥物發(fā)現(xiàn)的寶貴化學藥品資源。有些蘑菇莫屬纖孔菌和木層孔菌，例如纖孔菌，木層孔菌，木層孔菌，木層孔菌，作為治療胃腸癌，心血管疾病，肺結核，肝或心

11、臟病的傳統(tǒng)醫(yī)藥【1】，尤其是b－葡聚糖，考慮到他們所負責的生物活性，有許多關于多聚糖的隔離和生物活性都是來自藥的蘑菇的學術報告。松針層孔菌，或稱松木層孔菌，是刺革菌科、木層孔菌屬的一種真菌。拉丁學名：phellinuspini.。是針葉林里紅野生松針層孔菌松、落葉松、云杉最主要的、危害最大的火立木腐朽菌，是針葉林的大敵，現(xiàn)已經由原始林逐漸侵染人工林【2】層孔菌，對于針葉林無疑是一種癌，但是對于人類卻是抑制腫瘤、治療癌癥的一劑良藥。有人說

12、，這是以毒攻毒，其實不對，因為松木層孔菌本身無毒，名中醫(yī)專家邊同華先生的說法是扶邪【3。</p><p>　　子實體多年生，木栓質，無輛，菌蓋扁米球形至馬蹄形，4-14厘米7×24厘米，罕達23厘米×40厘米，厚2.5-18.5厘米或更大。蓋面初期有紅褐色膠狀皮殼 ，漸角質化而成灰色至黑色，并有寬的棱帶，邊緣往鈍，初期近白色，后漸變淡黃色至赤粟色，下側無子實層。菌肉近白色至淡黃褐色，有環(huán)紋，木

13、栓質至木質。厚0.5－2厘米，味苦。菌管多層，每層厚3－5毫米，淡黃色，管口白色至乳白色。孢子卵圓形或橢圓形，無色。生于松、云杉、冷杉、鐵杉及落葉松等針葉樹的樹干或朽木上。偶爾也生于闊葉樹的枯腐木上【5。</p><p>　　用于各種癌癥，食道癌、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌等，可改善患者的癥狀，如增加食欲和體重、減輕疼痛，有時可見腫瘤縮小、胸腹水減少。可明顯提高患者的細胞免疫功能，延長腫瘤患者的生存期，明

14、顯改善生存質量。子實體含齒孔酸等活性物質，是所有真菌中治療癌癥效果最好的品種，子實體提取物對小白鼠肉瘤180及艾氏腹水癌的抑制率均達100％【6］（《中國大型真菌原色圖鑒》73頁記載。） </p><p><b>　　主治</b></p><p>　　用于治療食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌等，可改善患者的癥狀如增加食欲和體重、減輕疼痛，有時可見腫瘤

15、縮小、胸腹水減少?？擅黠@提高患者的細胞免疫力功能，延長患者的生存期，改善生存質量。</p><p>　　1.2 國內外研究動態(tài)</p><p>　　1.2.1 中國科學家王穩(wěn)航、劉安軍等對松針層孔菌的藥理作用進行了比較系統(tǒng)的研究，結果顯示：松木層孔菌三種多糖均不同程度地提高了小鼠血清、心、肝、腦、脾中SOD、GSH-Px活力,降低了MDA生成量，而對TOAC值影響較?。煌瑫r，三種多糖均

16、顯著提高了小鼠體內血清NO生成量。結論：三種多糖的抗氧化機制可能與其它抗氧化劑不同，其對小鼠體內氧化壓力和抗氧水平呈雙重增加效果，可能是由于多糖作為免疫物質引起機體的免疫反應造成的。從Phellinuspini子實體中提取分離到一種水溶性多糖組分PS1，“能提高正常和免疫低下小鼠的巨噬細胞吞噬能力。此外，PS1能顯著促進脾細胞體外增殖能力（P＜0.01＝.結論：多糖PS1能顯著提高機體的免疫能力，可作為一種生物效應調節(jié)劑應用于醫(yī)藥或保健

17、食品領域 [7]</p><p>　　1.2.2 1.通過形態(tài)學，生理生化特征，以ITs序列分析,對實驗室前期分離到的層孔菌L8菌株進行了鑒定，確定其為木蹄層孔菌（GeneBank no.DQ 513402）。在明確菌種后，通過反復實驗，構建了木蹄層孔菌L8的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法，并優(yōu)化了其發(fā)酵工藝。結果表明當發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖5%,蠶蛹水解液1%，酵母粉0.5%，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0

18、.05%；發(fā)酵條件為:溫度25℃，初始pH 5.0，轉速100 rpm，通氣量1.0 vvm,接種體積10%（v/v），發(fā)酵周期6天時，層孔菌L8的菌絲生物量最大，可達18.11±1.08 g/L，是優(yōu)化前的2.3倍[8] 。后荷瘤鼠的體重變化也可以看出，層孔菌L8的發(fā)酵菌粉給藥后,荷瘤鼠的體重比給藥前都有所增加。以上結果表明層孔菌L8的發(fā)酵菌粉,在腫瘤治療方面,具有潛在的開發(fā)價值。2.采用體外人源的腫瘤細胞作為篩選模型，對1

19、0余種層孔菌進行了抗腫瘤活性評價和活性成分的分析，結果發(fā)現(xiàn)Hispolon為一些層孔菌中共有的一個活性成分,并發(fā)現(xiàn)Hispolon對許多腫瘤細胞表現(xiàn)出劑量依賴性的生長抑制作用,其中對胃癌細胞S</p><p><b>　　2 實驗部分</b></p><p><b>　　2.1.1 試劑</b></p><p>　　表

20、2-1 化學藥品一覽表</p><p>　　表2-2 主要試劑的物理性質</p><p><b>　　2.1.2 儀器</b></p><p>　　表2-3 主要儀器一覽表</p><p>　　其他小型儀器：量筒（5ml、50ml）、球形冷凝管、電子天平等</p><p>　　2.2.1 硅膠

21、柱的簡介</p><p>　　色譜和工業(yè)水處理領域中，無定形硅膠已得到了廣泛的應用，它具有多孔的無定形結構，不產生任何x 射線衍射[1,4]。硅膠的表面存在著硅醇基團(si-oh)和暴露的硅氧烷鍵(si-o-si)。硅醇基團是強吸附的極性基團，而硅氧烷鍵是疏水基團。硅氧烷鍵上的δ鍵被dπ-pπ作用而加強，氧原子上的孤對電子參與π作用，不能參與給體與受體間的相互作用，不能形成氫鍵。scott和kucera證實硅氧烷

22、基團幾乎不吸附極性溶劑分子。然而，由于硅氧烷鍵的疏水作用性，可以吸附某些非極性溶劑分子。對硅膠改性而言，硅醇基比硅氧烷基重要得多。硅醇基團可以孤立、成對(雙生)和締合(連位)等不同的方式存在于硅膠表面。最近研究表明，不僅兩個或兩個以上的締合硅醇基團可以形成鍵合對，甚至成對硅醇基團也可以形成鍵合對。硅膠表面的結構可以通過許多方法進行測定。一般情況下，隨著比表面積的增加，硅膠表面上硅醇基團的濃度略有降低。通常硅醇含量的測定方法有同位素交換法

23、、滴定法、光譜法和烷基鋁法等。nawrock[1]報道了用同位素交換法測定硅膠表面的硅醇基濃度是8.0±1.0μmol/m2，而且這個數(shù)值常常被視為硅膠的物理化學常數(shù)。硅醇基</p><p><b>　　硅膠柱層析原理 </b></p><p>　　硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質在硅膠上的吸附力不同而得到分離， 一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較弱

24、的物質不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。 </p><p><b>　　硅膠柱層析流動相 </b></p><p>　　極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 </p><p>　　硅膠柱層析慣用方法 </p>&

25、lt;p>　　1.稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100 mL也可以。 </p><p>　　2.攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙

26、酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。 </p><p>　　3.裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內。隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。 </p><p>　　4.壓實。

27、沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應進行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產生開裂。 </p><p>　　5.上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會沖壞硅膠表面。 </p><p>　　6.過

28、柱和收集。柱層析實際上是在擴散和分離之間的權衡。太低的洗脫強度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10 mg上樣量，1g硅膠H，0.5 mL收一餾分；1-2 g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50 mL收一餾分。 </p><p>　　7.檢測。要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會損失較多產品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個數(shù)量級。 </p><p>　　8.送譜

29、。收集的產品旋干，在送譜前通常需要重結晶。如果樣品太少或為液體，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5 ppm左右所謂的“硅膠”峰[13]</p><p><b>　　2.2.3 濕法</b></p><p>　　1、柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。</p><p>　　壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產品收集的時間，但

30、是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。以前曾經大量的過減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒動過減壓的念頭了。加

31、壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。 2、關于柱子的尺寸，應該是粗長的最好 柱子長了，相應的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^?。?，這樣相對的減小了分離

32、的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知</p><p>　　先把硅膠用適當?shù)娜軇┌鑴蚝?，再填入柱子中，然后再加壓用淋洗劑“走柱子”，本法最大的?yōu)點是一般柱子裝的比較結實，沒有氣泡。</p><p>　　濕法裝柱的優(yōu)點是裝填的密實、均勻，缺點是要選擇合適的溶劑，而且如果溶劑含水會影響硅膠活性[１４]</p><p>　　2.3 分離路線

33、設計</p><p>　　利用不同物質通過硅膠柱的時間是不同進行分離，通過開始應用石油醚單獨洗滌數(shù)次并旋蒸，然后用不同的石油醚與乙酸乙酯的比例配比進行過柱，安比例越來越大分別是100:5、100:10、100:20、100:50、100:100、100:200、100：500進行實驗，最后用乙酸乙酯過柱和甲醛。此方法需要注意的是過柱時間要長，旋蒸好之后產物要注意回收和保存。旋蒸之后的石油醚和乙酸乙酯還可以一直沿用

34、。這樣可以減少原料的浪費和降低實驗的成本。</p><p><b>　　3 結果與討論</b></p><p><b>　　圖1</b></p><p>　　這是總物質的圖譜，可以發(fā)現(xiàn)混合物比較多。</p><p><b>　　圖2</b></p><p&

35、gt;　　這圖說明有較多的多元烷烴。</p><p><b>　　圖3 </b></p><p>　　這種物質被分離出來了。</p><p><b>　　圖 4</b></p><p><b>　　被分離出來了。</b></p><p><b&

36、gt;　　圖5</b></p><p><b>　　被分離出來。</b></p><p><b>　　圖6</b></p><p><b>　　被分離出來。</b></p><p><b>　　圖7</b></p><p&g

37、t;<b>　　被分離出來。</b></p><p>　　以上圖片是我本次論文的實驗結果，我是從其中68張中選取了幾張比較清稀的圖片。第一張是整個物質即提取物的混合物的圖譜，以后幾張依次按照比例下來的。通過這次實驗我學會了濕法層析，發(fā)現(xiàn)了混合物的分離方法。</p><p>　　在本次實驗結果的中我發(fā)現(xiàn)了以下各種物質，有各種多元烷烴 </p><p&

38、gt;　　，還有一些物質還不能被分離出來，這些物質是松針層孔菌乙酸乙酯提取物主要物質，還有一些事次要物質，從中發(fā)現(xiàn)松針層孔菌乙酸乙酯提取物時有很多種物質組成的。其各種物質也是十分豐富的。</p><p>　　本次實驗我有些失敗的地方是硅膠柱不能完全分離這些物質，還要通過其他方法分離和鑒別。由于時間和設備的關系我只能做到這里。出現(xiàn)這的原因有如下：1過柱時間太快，每瓶250毫升的收集量有點多。2硅膠柱的分離速度有些物

39、質是同時下去的，導致物質很難分離。3比例變大過快導致分離不完全。</p><p>　　我對實驗的一些改進和意見是以下幾點：1適當加長過柱時間。2硅膠柱無法完成實驗改用其他柱。3適當可以用用核磁共振等方法。</p><p>　　我對松針層孔菌乙酸乙酯提取物研究到此告一階段，希望對以后的研究能有幫助。</p><p><b>　　參考文獻</b>&

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