基于FXR的蒲公英乙酸乙酯提取物利膽作用研究.pdf

1、背景：膽汁淤積(Cholestasis)，又稱為膽汁淤積綜合征，指在肝細(xì)胞或膽管水平膽汁生成、分泌或流動(dòng)障礙，導(dǎo)致膽汁不能正常進(jìn)入十二指腸的一組疾病共同的臨床癥狀，而引起黃疽、皮膚瘙癢等癥狀的綜合征[1-2]。膽汁淤積主要包括肝外膽汁淤積和肝內(nèi)膽汁淤積兩大類，是許多肝膽疾病共有的基礎(chǔ)病變，其病因包括病毒感染、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、藥物性肝損、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積等多種因素，因此膽汁淤積癥是內(nèi)科臨床上的常見綜合癥，發(fā)病率極

2、高（如妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病率高達(dá)13％），嚴(yán)重威脅人類健康。蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）具有清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋功效，臨床上對(duì)慢性膽囊痙攣及結(jié)石癥有效。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英能促進(jìn)正常大鼠膽汁分泌，保護(hù)肝細(xì)胞的藥理活性，有望開發(fā)成為一種臨床上治療膽汁淤積的新藥。但其作用機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。因此，利用現(xiàn)代化分析手段和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)利膽的中草藥如蒲公英作用于機(jī)體的

3、信號(hào)通路進(jìn)行探索，進(jìn)一步研究蒲公英保肝利膽的分子機(jī)制，不僅為開發(fā)安全有效的抗膽汁淤積藥物提供新的研究思路，還可指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥，具有重要的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　目的：研究蒲公英乙酸乙酯提取物(The Ethyl Acetate Extract Of Taraxacum，TEE)與咖啡酸(Caffeic acid)通過法尼醇受體(Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)及其靶基因膽固醇7a羥化酶(Cholesterol

4、7a-hydroxylase，CYP7A1)和膽鹽輸出泵(Bilesalt export pump，Bsep)對(duì)α-萘異硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠護(hù)肝利膽的作用及機(jī)制。
　　方法：⑴觀察膽汁淤積模型大鼠灌服蒲公英正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取物后，對(duì)膽汁排泄、肝功能等生化指標(biāo)表達(dá)的影響。模型組灌胃給予α-萘異硫氰酸酯ANIT(100 mg/kg)造成急性肝內(nèi)膽

5、汁郁積模型。蒲公英正丁醇提取物組灌胃給予蒲公英正丁醇提取物及灌服ANIT(100 mg/kg)造模。蒲公英乙酸乙酯提取物組灌胃給予蒲公英乙酸乙酯提取物及灌服ANIT(100 mg/kg)造模。蒲公英石油醚提取物組灌胃給予蒲公英石油醚提取物及灌服ANIT(100 mg/kg)造模。陽性對(duì)照組灌胃給予熊去氧膽酸(50mg/Kg)及灌服ANIT(100 mg/kg)造模。模型對(duì)照組灌胃給予0.5％ CMC-Na溶液和植物油（用于溶解ANIT的

6、溶劑）作為模型對(duì)照。各組大鼠末次藥后2h，腹腔注射20％烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠，進(jìn)行膽管插管手術(shù)，收集膽汁、全身血液和肝臟。測(cè)定膽汁流，稱量肝重，檢測(cè)肝功能相關(guān)生化指標(biāo)(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血漿中總膽紅素(TB)和總膽汁酸(TBA))的含量。⑵蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)的急性毒性考察。將100只昆明(KM)小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為10組，每組10只，雌雄各半。按最大

7、劑量開始給藥，之后以0.75倍遞減，給藥4h后正常飼養(yǎng)，觀察7d。⑶蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)指征成分咖啡酸在正常大鼠和ANIT誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠中的藥動(dòng)學(xué)比較。建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏的生物樣品中咖啡酸的HPLC檢測(cè)方法，并且對(duì)專屬性、靈敏度、線性范圍、回收率、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性等方法學(xué)進(jìn)行確認(rèn)。正常大鼠和ANIT誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠灌服TEE，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，比較TEE在正常大鼠和

8、ANIT誘導(dǎo)后48h的急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠血漿內(nèi)血藥濃度的差異。⑷觀察膽汁淤積模型大鼠分別灌服TEE及咖啡酸高中低三個(gè)劑量后，對(duì)膽汁排泄、肝功能等生化指標(biāo)、膽汁池、病理切片分析、肝臟中FXR、CYP7A1和Bsep的基因表達(dá)及其蛋白表達(dá)的差異性。模型組灌胃給予(100 mg/kg)造成急性肝內(nèi)膽汁郁積模型。TEE（高中低）組灌胃給予相應(yīng)劑量的TEE及灌服ANIT(100 mg/kg)造模?？Х人峤M灌胃給予相應(yīng)劑量的咖啡酸及灌服ANI

9、T(100 mg/kg)造模。陽性對(duì)照組灌胃給予熊去氧膽酸(50mg/Kg)及灌服ANIT(100 mg/kg)造模。模型對(duì)照組灌胃給予0.3％ CMC-Na溶液和植物油作為模型對(duì)照。各組大鼠末次藥后2h，腹腔注射20％烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠，進(jìn)行膽管插管手術(shù)，收集膽汁、全身血液和肝臟。測(cè)定膽汁流，稱量肝重，檢測(cè)肝功能相關(guān)生化指標(biāo)（ALT、AST、ALP、TB和TBA的含量和對(duì)肝臟組織進(jìn)行病理切片分析。采用LC-MS/MS檢

10、測(cè)膽汁池中的17種膽酸成分并采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)肝臟中FXR、CYP7A1和Bsep的基因表達(dá)水平及Western Blot測(cè)定其蛋白表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：①在ANIT灌胃造成大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積實(shí)驗(yàn)中，與模型對(duì)照組比較，模型組膽汁排泄量和膽汁中TB、TBA的含量均降低（P＜0.05），肝比重增大（P＜0.05），血漿中ALT、AST、ALP、TB、DB、TBA的含量升高（P＜0.05）。肝臟勻漿液中TBA和TB含

11、量升高(P＜0.05)。分別給藥后發(fā)現(xiàn)，正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物組，與模型組比較，乙酸乙酯提取物組能顯著增加膽汁排泄量（P＜0.05），降低血漿中ALT、AST、ALP、TB、DB、TBA和肝臟中TB、DB、TBA的含量（P＜0.05），以及顯著提高膽汁中TB的含量（P＜0.05）。②蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)半數(shù)致死量LD50=306.25mg/kg，95％的可信限=249.75-376.99mg/kg。小鼠死亡

12、原因可能為肝臟局部缺血性壞死。③咖啡酸的血藥濃度在0.1～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.9994)，日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度等方法學(xué)均符合要求，血漿中無內(nèi)源性基質(zhì)干擾，穩(wěn)定性良好。與正常大鼠相比，TEE在急性膽汁淤積模型大鼠組的AUC(33.15±2.97vs9.61±0.76)更大，但清除率(1.97±0.26 vs5.73±0.37)較小。④在ANIT灌胃造成大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，TEE高中劑量組膽

13、汁排泄量、膽汁池和膽汁中TBA的含量均升高(P＜0.05)，血漿中ALT、AST、ALP、TB、TBA的含量降低（P＜0.05），肝臟勻漿液中TBA含量降低(P＜0.05)，病理切片下觀察肝臟損害情況顯著減輕。在基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平上，TEE能增加肝臟中FXR、CYP7A1、Bsep基因和蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。而蒲公英有效成分咖啡酸能使膽汁排泄量、膽汁池和膽汁中TB、TBA的含量均升高（P＜0.05），血漿中AST、ALP、TB

14、、TBA的含量降低（P＜0.05），肝臟勻漿液中TB含量降低（P＜0.05）;病理切片下觀察肝臟損害情況無明顯改善;在基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平上，咖啡酸能增加肝臟中FXR、Bsep基因和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，對(duì)CYP7A1的作用比TEE低。
　　結(jié)論：蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)及其活性成分咖啡酸能不同程度地緩解ANIT導(dǎo)致的膽汁異常蓄積和返流入血的病變，從而減少黃疸，改善肝功能;TEE能刺激FXR表達(dá)的上調(diào)，表達(dá)增強(qiáng)的FX