生物科學(xué)畢業(yè)論文一株共附生微生物對真菌性植物病害防治的試驗

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　一株共附生微生物對真菌性植物病害防治的試驗</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物科學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄<

3、;/b></p><p><b>　　摘要I</b></p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1 材料與方法2</b></p><p>　　1.1 實驗材料2</p><p>　　1.1.1 供試菌株2&l

4、t;/p><p>　　1.1.2 培養(yǎng)基2</p><p>　　1.2 實驗方法2</p><p>　　1.2.1 共附生放線菌的分離2</p><p>　　1.2.2 發(fā)酵及發(fā)酵液提取3</p><p>　　1.2.3 發(fā)酵液提取物對植物病原真菌的抑制作用測定3</p><p>　　1.

5、2.4 發(fā)酵上清液對白粉病病原真菌生長抑制的野外試驗3</p><p><b>　　2 結(jié)果4</b></p><p>　　2.1 ?？哺缴啪€菌DH102菌株的分離4</p><p>　　2.2 ?？哺缴啪€菌DH102發(fā)酵液提取物對植物病原真菌抑制作用4</p><p>　　2.3 海葵共附生放線菌DH1

6、02發(fā)酵上清液對白粉病病原真菌生長抑制的野外試驗結(jié)果5</p><p><b>　　3 討論7</b></p><p>　　3.1 海洋放線菌作為防治真菌性植物病害的潛力7</p><p>　　3.2 ?？哺缴啪€菌DH102對植物白粉病的防治7</p><p><b>　　參考文獻8</b&

7、gt;</p><p>　　附譯文錯誤!未定義書簽。</p><p>　　附譯文原文錯誤!未定義書簽。</p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要] 采用瓊脂擴散法測定海洋放線菌DH -102菌株發(fā)酵液對12種植物病原真菌

8、的抑制作用。對未定種?？M行共附生放線菌分離，共分離到共附生海洋放線菌4株，其中菌株DH102從?？挠|手部位分離到，由于發(fā)現(xiàn)該菌的菌液提取物有較好的抗蟲作用,結(jié)果表明：菌株DH102的發(fā)酵液提取物的普遍對三株病原真菌有較好的抑菌效果，表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，其對香蕉根霉腐爛病病菌和番茄早疫病病菌抑菌圈分別為12、11mm；?？哺缴啪€菌菌株DH102的發(fā)酵液以1/3體積的PBS緩沖液稀釋后，野外施用發(fā)現(xiàn)對狹葉十大功勞白粉病抑制效果不

9、甚明顯，兩個月不定期的處理后病葉仍然較高， 但可以看得出白粉的斑狀有所縮小</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 海洋放線菌；植物病原真菌；抑菌作用</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract] Agar diffusion method using marine actinomycetes DH

10、-102 Strains on 12 species of plant pathogenic fungi. A total of undetermined species of sea anemones were isolated epiphytic actinomycetes were isolated from the epiphytic marine actinomycetes were 4 strains, including

11、strains DH102 isolated from sea anemone tentacles to the site, due to the strain of the bacterium found in extracts of a more the role of a good insect, the results show that: strain DH102 extracts of the fermentatio<

12、/p><p>　　[Key words]: marine actinomycete; botanic pathogenic fungi; antibacterial effect</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　隨著陸生生物資源的減少,人們開始把目光轉(zhuǎn)向其他生態(tài)系統(tǒng),其中占地球資源 71%的海洋更成為國內(nèi)外新藥研究的

13、重點和熱點海洋微生物資源極其豐富,而且在特殊的生存環(huán)境中,海洋微生物能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎和功能天然的活性物質(zhì),越來越多的試驗證明,海洋微生物是海洋動植物活性物質(zhì)的真正生物源。目前,海洋微生物活性物質(zhì)研究發(fā)展迅速,國內(nèi)外已有從放線菌、真菌、細(xì)菌、微藻等海洋微生物中分離出具有抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)功能以及其他用途的生物活性物質(zhì)的相關(guān)報道,其中許多海洋生物代謝產(chǎn)物具有殺滅害蟲、除雜草、抗農(nóng)林業(yè)病原菌等多種作用,可用于生物農(nóng)藥的開發(fā)。有關(guān)專

14、家預(yù)測,海洋微生物將會成為新的醫(yī)用和農(nóng)用抗菌素的重要資源。</p><p>　　病蟲害是我國農(nóng)林生產(chǎn)的大敵,據(jù)不完全統(tǒng)計,近幾年我國糧食產(chǎn)量因病蟲害每年損失近1000億 kg, 占全年糧食的 1/ 10,而且受異常氣候影響,我國農(nóng)作物病蟲害處于多發(fā)、頻發(fā)、重發(fā)態(tài)勢。人們已經(jīng)開始意識到傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥所造成的污染環(huán)境、損害人類健康、破壞生態(tài)環(huán)境等缺點,對生物農(nóng)藥的研究越發(fā)關(guān)注。海洋中蘊藏極其豐富的藥用資源,而且很多天然

15、產(chǎn)物特異結(jié)構(gòu)和藥理作用都是陸生生物無法比擬?，F(xiàn)代藥理研究表明,很多海洋微生物次生代謝產(chǎn)物具有較好的防治農(nóng)業(yè)害蟲效果。目前,國內(nèi)外研究較多的主要是微生物殺蟲劑、殺菌劑和農(nóng)用抗生素。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　實驗材料</b></p><p><b>　　供試菌株&l

16、t;/b></p><p>　　放線菌DH102菌株：由采自舟山東部朱家尖海域的?？麡悠?，從其觸手處分離獲得并保存。</p><p>　　圖-1 采集的海葵樣</p><p>　　Tab-1 Samples collected from sea anemones </p><p>　　植物病原真菌：所用三株植物病原真菌為：毛霉菌(Mu

17、cor miehei)，番茄早疫病病菌(Alternaria solani)，和香蕉根霉腐爛病病菌（Rhizopus stolonifer）。由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。</p><p><b>　　培養(yǎng)基</b></p><p>　　放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基用蛋白胨10g, 酵母提取物 2g, 面粉2g, 人工海水1000ml, pH 7.8。</p>&

18、lt;p>　　真菌抑制實驗培養(yǎng)基：半海水配置的PDA培養(yǎng)基；</p><p><b>　　實驗方法</b></p><p>　　本試驗于2010年8月到2011年3月進行。</p><p><b>　　共附生放線菌的分離</b></p><p>　　共附生放線菌的分離與同組翁周能同學(xué)的論文相同

19、，用高氏一號培養(yǎng)基 ( 人工海水) 為分離培養(yǎng)基。使用前加入終濃度為50×10 -6的重鉻酸鉀作為細(xì)菌和真菌的抑制劑。</p><p>　　將采集到的?？麡悠废扔?.2μm濾膜過濾除菌的海水充分沖洗數(shù)次，以除去海葵表面松散附生的微生物，然后用70%的乙醇浸泡3min，做表面消毒，再用除菌海水洗凈殘留乙醇。用無菌刀片小心削割，切取小塊組織于滅菌Eppendorf管中研磨，然后加入1ml滅菌海水，振蕩混勻即

20、得組織勻漿。以上勻漿做10-1、10-2、10-3、10-4倍的梯度稀釋。吸取四個稀釋濃度即原液、10-1、10-2、10-3，各200μl涂布于高氏I號和CSA分離培養(yǎng)基平板，每個濃度3個重復(fù)。</p><p>　　將涂布好的平皿放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于28℃下培養(yǎng)21-28天。</p><p><b>　　發(fā)酵及發(fā)酵液提取 </b></p><p

21、>　　純化后的菌株經(jīng)斜面活化后，將孢子用無菌水洗下制成孢子懸液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基 ( 500 mL 錐形瓶裝液量 200 mL，分批進行總共5L的發(fā)酵量)，28 ℃ 130r/min 搖床培養(yǎng)5.5 d；發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心過濾，輔以流動水減壓抽濾，濾液在分液漏斗中用250ml乙酸乙酯萃取得提取液；濾渣用乙酸乙酯浸泡超聲波提取30min，過濾得濾液。合并上述乙酸乙酯提取液，用EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用氯仿/甲醇溶解

22、轉(zhuǎn)移到 Eppendorf管中，各菌株的發(fā)酵提取液分別用1:1的氯仿/甲醇定容至1ml，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩１静糠钟诒拘ａt(yī)學(xué)院5樓實驗室進行。</p><p>　　發(fā)酵液提取物對植物病原真菌的抑制作用測定</p><p>　　采用瓊脂擴散法。參照吳少杰, 王淑軍, 李富超, 等. 膠州灣海洋放線菌的分布及其抗微生物活性 中國海洋藥物, 2006, 25(5): 10.<

23、;/p><p>　　將病原真菌的孢子用無菌水洗下制成孢子懸液，涂布接種于PDA培養(yǎng)基。取直徑φ6mm的濾紙片，蘸取海洋放線菌DH102菌株的發(fā)酵提取液約100 μL貼于含菌平板上, 25℃倒置恒溫培養(yǎng)，觀察病原菌菌落生長狀況，培養(yǎng)1~2d后觀察、測量抑菌圈直徑。</p><p>　　發(fā)酵上清液對白粉病病原真菌生長抑制的野外試驗</p><p>　　無菌發(fā)酵液的制備：發(fā)酵

24、結(jié)束后，除少部分用于提取發(fā)酵液提取物外，將其它培養(yǎng)物的發(fā)酵液用棉紗布過濾，濾液以5000rpm離心，按1（稀釋液）：3（母液）的比例用PBS磷酸緩沖劑稀釋發(fā)酵母液，貯存于水瓶中備用。</p><p>　　野外試驗以舟山定海區(qū)東山路旁綠化帶某段患白粉病的狹葉十大功勞為試驗對象。對十大功勞灌木叢的一個固定的小塊用噴花壺裝上發(fā)酵液噴灑葉片，從3月至5月根據(jù)晴雨等氣候情況不定期進行，多在傍晚噴灑，施用量以葉片略濕滴水即停

25、。白粉病的病情描述參照沈潔的分級標(biāo)準(zhǔn)。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　?？哺缴啪€菌DH102菌株的分離</p><p>　　對未定種海葵進行共附生放線菌分離，共分離到共附生海洋放線菌4株，其中菌株DH102從海葵的觸手部位分離到，由于發(fā)現(xiàn)該菌的菌液提取物有較好的抗蟲作用，因此拿來做進一步對植物病原菌的防治試驗

26、。</p><p>　　圖-2 分離出的?？哺缴啪€菌菌株DH102</p><p>　　Tab-2 Were isolated from the sea anemone epiphytic strains of actinomycetes</p><p>　　海葵共附生放線菌DH102發(fā)酵液提取物對植物病原真菌抑制作用</p><p>　

27、　實驗發(fā)現(xiàn)，菌株DH102的發(fā)酵液提取物的普遍對三株病原真菌有較好的抑菌效果，表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，其對香蕉根霉腐爛病病菌和番茄早疫病病菌抑菌圈分別為12、11mm（圖3） 。</p><p>　　?？哺缴啪€菌DH102發(fā)酵上清液對白粉病病原真菌生長抑制 的野外試驗結(jié)果</p><p>　　海葵共附生放線菌菌株DH102的發(fā)酵液以1/3體積的PBS緩沖液稀釋后，野外施用發(fā)現(xiàn)對狹葉十大

28、功勞白粉病抑制效果不甚明顯，兩個月不定期的處理后病葉仍然較高， 但可以看得出白粉的斑狀有所縮小（圖4）。按照沈潔的病葉分類標(biāo)準(zhǔn)，起初局部處于9級及以上的病葉經(jīng)兩個月的不定期處理后可見病葉斑點面積縮小，達到7級，但仍有大部分葉子病斑面積沒有改觀。</p><p><b>　?。ˋ）</b></p><p><b>　　(B)</b></p&g

29、t;<p>　　圖 4 ?？哺缴啪€菌菌株DH102的發(fā)酵液對狹葉十大功勞白粉病的抑制效果局部圖 上圖(A)為病葉于2011年3月份拍照 (B)為5月中旬的拍照結(jié)果。</p><p>　　Tab 4 anemones were epiphytic strain DH102 Actinomycetes fermentation broth powdery mildew on the narrow-l

30、eaf Mahonia inhibitory effect of the local map above (A) for the diseased leaves in March 2011 photo (B) to mid-May photo results</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　海洋放線菌作為防治真菌性植物病害的潛力</

31、p><p>　　隨著當(dāng)今人們生活水平的提高，對生活質(zhì)量提出更高的要求，食品安全問題日益關(guān)注。人類獲得優(yōu)質(zhì)安全的糧食及水果蔬菜成為優(yōu)質(zhì)生活的必然訴求。病菌及蟲害是制約糧食生產(chǎn)及果蔬種植、花卉栽培的一個重要因素。長期以來，利用化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展起到了十分重要的作用。但也導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥在自然界和食物鏈中長期累積，造成環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞。21世紀(jì)人類全面回歸自然，發(fā)展綠色低碳經(jīng)濟的潮流中，海洋微生物可以作為

32、一種綠色農(nóng)藥來代替生產(chǎn)過程污染嚴(yán)重、毒性強、對環(huán)境不友好的合成類化學(xué)農(nóng)藥的使用。</p><p>　　根據(jù)文獻中評價抗菌活性的標(biāo)準(zhǔn),抑菌圈為7-11 mm為低活性，11-16 mm為中等活性，而我們的實驗表明?？哺缴啪€菌菌株DH102的發(fā)酵液提取物在實驗室水平有中等強度的抑菌活性，對受試的三株植物病原真菌均表現(xiàn)出抗菌效果。</p><p>　　我國東海海域?？贩N多有分布，但由于各種原

33、因，有關(guān)其海葵共附生微生物的對抗植物病原菌的報道并不多見。應(yīng)該更好的開發(fā)利用這一海洋微生物資源。</p><p>　　?？哺缴啪€菌DH102對植物白粉病的防治</p><p>　　本試驗以狹葉十大功勞為對象，進行了?？哺缴啪€菌菌株DH102的發(fā)酵上清液作為生物農(nóng)藥使用的潛在價值評估。十大功勞為小檗科十大功勞屬植物。有闊葉與狹葉十大功勞兩種。可做盆栽，園林種植及藥用。狹葉十大功勞（M

34、ahonia bealei） 廣泛應(yīng)用于道路綠化、大型綠地的景觀綠籬或綠帶。狹葉十大功勞白粉病是其主要病害， 感病后可使葉片變黑，嚴(yán)重時引起枝條大批死亡。【---沈潔，徐薇玉，管麗琴。上海農(nóng)業(yè)科技，2007，3：104-105】在藥物防治的選擇上，主要有治療性殺真菌劑三唑酮乳油（粉銹寧），和另一種保護性殺菌劑，如75%的達科寧（百菌清）可濕性粉劑，來防止白粉病的分生孢子侵染新葉。 【--周定瑞，狹葉十大功勞白粉病防治，園林，2006，8

35、：44）】在本試驗中，?？哺缴啪€菌菌株DH102的發(fā)酵上清液經(jīng)1/3的PBS稀釋后野外對抗白粉病的效果并不甚理想，但本試驗由于時間和條件的限制只是進行了一個稀釋度的試驗，更多的發(fā)酵液稀釋度有待檢驗。海葵共附生放線菌菌株DH102的發(fā)酵上清液仍不失具備一定的作為生防農(nóng)藥的應(yīng)用潛力。另外，因為野外試驗的不可控因素很多，受自然條件，晴雨氣候變化影響頗大</p><p><b>　　參考文獻</b&g

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