家蠶腸道產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分離鑒定及其酶基因的克隆.pdf

1、家蠶是產(chǎn)生較大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲，家蠶腸道微生物對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及微生態(tài)平衡具有重要作用。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于家蠶腸道微生物的研究報(bào)道，多集中于腸道微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、菌群致病性等方面，而關(guān)于家蠶腸道菌應(yīng)用于產(chǎn)酶益生菌的研究較少。腸道產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌，可幫助宿主更好地消化淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此外該類菌還有許多其它的益生功能。近些年來(lái)，關(guān)于益生菌在動(dòng)物微生態(tài)制劑方面的應(yīng)用，多集中于水產(chǎn)類及家禽生產(chǎn)中，而蠶用益生菌的研究未見(jiàn)報(bào)道，蠶業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中一直

2、存在著葉絲轉(zhuǎn)化率較低，蠶病發(fā)生率高等問(wèn)題，因而研究蠶腸道菌及其產(chǎn)酶并對(duì)產(chǎn)酶基因進(jìn)行原核表達(dá)分析，在改善蠶腸微生態(tài)環(huán)境及蠶人工飼料開(kāi)發(fā)上有一定意義。
　　 本文從大造品種家蠶5齡幼蟲腸道中通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離純化出部分可培養(yǎng)細(xì)菌，通過(guò)含淀粉的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基篩選得到其中兩株產(chǎn)淀粉酶菌株，用細(xì)菌擴(kuò)增通用引物分別對(duì)產(chǎn)酶菌進(jìn)行16SrDNA序列擴(kuò)增并克隆測(cè)序，將所得測(cè)序結(jié)果與GenBank已有序列進(jìn)行比對(duì)，該兩株菌均與蠟樣芽孢桿菌序列有

3、99％的同源性，結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)觀察及菌體細(xì)胞革蘭氏染色涂片顯微鏡鏡檢分析結(jié)果，鑒定所得菌株為芽孢桿菌屬蠟樣芽孢桿菌，DNS法測(cè)定菌株所產(chǎn)淀粉酶酶活，結(jié)果顯示，該家蠶腸源性細(xì)菌所產(chǎn)酶具一定酶活力，且菌株的16SrDNA序列也與已有報(bào)導(dǎo)的蠟樣芽孢桿菌序列有一定差異，因而具有一定的研究意義。
　　 鑒定得知分離產(chǎn)酶菌種屬后，根據(jù)已解析的蠟樣芽孢桿菌α淀粉酶(Ec.3.2.1.1)基因設(shè)計(jì)引物，從該兩株細(xì)菌的基因組DNA中分別擴(kuò)增出了產(chǎn)

4、淀粉酶基因片段，經(jīng)克隆、測(cè)序和分析獲得了家蠶腸源性蠟樣芽孢桿菌淀粉酶基因的完整編碼區(qū)ORF框序列，產(chǎn)酶基因擴(kuò)增分別得到3414、3378個(gè)堿基序列，均包括完整的編碼區(qū)1761bp，可編碼586個(gè)氨基酸，比對(duì)分析屬于α淀粉酶超級(jí)家族，但這兩株菌的產(chǎn)酶基因序列存在一定差異，其中，Dza號(hào)菌793位堿基為T，而DZh為C，Dza號(hào)菌1381位堿基為A，DZh為G，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Dza號(hào)菌265位氨基酸為S，DZh為P，Dza號(hào)菌461位氨基

5、酸為I，而DZh為V。將Dza號(hào)菌α淀粉酶基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)，得到分子量為66kD左右的目的蛋白，與DNAStar軟件預(yù)測(cè)產(chǎn)物蛋白大小相符合。
　　 根據(jù)該編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物重新擴(kuò)增獲得目的基因序列，連接到表達(dá)載體pET28a(+)構(gòu)建了該產(chǎn)酶基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到含稀有密碼子編碼氨基酸的大腸桿菌宿主細(xì)胞Transetta（DE3）中，用IPTG進(jìn)行了不同濃度的誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)