中度嗜鹽菌產(chǎn)酯酶菌株的篩選鑒定、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、本論文對(duì)從黃海海岸鹽場(chǎng)分離篩選的兩株高產(chǎn)酯酶中度嗜鹽菌菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性研究以及基于16S·rRNA序列的分子生物學(xué)分析，并對(duì)菌株產(chǎn)酯酶條件及部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　 1.中度嗜鹽菌高產(chǎn)酯酶菌株的篩選
　　 將取自青島市城陽(yáng)區(qū)上馬鎮(zhèn)東風(fēng)鹽場(chǎng)的土樣、泥樣及水樣進(jìn)行富集培養(yǎng)分離，經(jīng)嗜鹽菌培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得155株嗜鹽菌，然后對(duì)分離純化的細(xì)菌在添加Tween80的DSMZ755培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過(guò)是否產(chǎn)生透明圈

2、或暈圈的現(xiàn)象篩選出產(chǎn)脂酶的菌株73株。根據(jù)透明圈或暈圈的大小與菌株直徑之比，篩選到10株高效降解Tween80的菌株。后經(jīng)搖瓶復(fù)篩，測(cè)定發(fā)酵液中酶活力大小，得到兩株高產(chǎn)酯酶的中度嗜鹽菌菌株DF-I11和DF-B6。對(duì)菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的上清液及破碎菌體進(jìn)行非變性凝膠電泳，后經(jīng)RR固藍(lán)特異染色，菌株DF-I11破碎菌體與菌株DF-B6上清液所產(chǎn)脂酶都表現(xiàn)為酯酶性質(zhì)，而有所區(qū)別的是前者產(chǎn)胞內(nèi)酶，而后者產(chǎn)胞外酶。
　　 2.胞內(nèi)酯酶產(chǎn)生

3、菌株DF-I11的鑒定、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)
　　 菌株DF-I11形態(tài)學(xué)鑒定為革蘭氏陽(yáng)性，菌體短桿狀，長(zhǎng)1.5-4.0μm，直徑0.8-1.0μm，菌株生長(zhǎng)的最適條件分別為37℃，NaCl10％，pH8.5;生理生化分析顯示，菌株能夠利用D-果糖、D-半乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-葡萄糖作為唯一碳源，氧化酶、接觸酶及脂酶陽(yáng)性。經(jīng)16SrRNA序列分析，菌株DF-I11與Halobacillus菌屬的同源性高于97％，與H.locis

4、alis具有99.7％的相似性。單因素設(shè)計(jì)分析最佳產(chǎn)酶條件表明，菌株DF-I11最適生長(zhǎng)條件下，總酶活達(dá)到最高的時(shí)間為48h，其它最適產(chǎn)酶條件分別為NaCl濃度10％(w/v)、pH值9.0、裝樣量70ml/250ml。部分酶學(xué)特性研究顯示，菌株DF-I11酯酶反應(yīng)的最適條件為pH8.5，溫度60℃;金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+能夠增強(qiáng)酶活反應(yīng)，而Zn2+、Cu2+、Fe3+等抑制酶活;酯酶以對(duì)硝基苯酚辛酸酯為底物時(shí)相對(duì)酶活最高

5、，其次為乙酸酯、丁酸酯，幾乎不降解大于十個(gè)碳鏈的羧酸酯。
　　 3.胞外酯酶產(chǎn)生菌株DF-B6的鑒定、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)
　　 形態(tài)學(xué)觀察表明，菌株DF-B6革蘭氏染色陰性，菌體弧狀，大小0.7-1.8μm，兩端有鞭毛;生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明菌株能夠在4-40℃生長(zhǎng)，菌株生長(zhǎng)的最適NaCl濃度為5％-10％，最適pH為8.0;能夠利用蔗糖、D-果糖、D-半乳糖、D-山梨醇作為唯一碳源;氧化酶、接觸酶及脂酶陽(yáng)性。菌株經(jīng)16S

6、rRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，菌株DF-B6為Idiomarina屬，定名為Idiomarinasp.strainDF-B6;單因素試驗(yàn)分析最佳產(chǎn)酶條件表明，菌株DF-B6在最適生長(zhǎng)條件下總酶活達(dá)到最大的時(shí)間為36h，產(chǎn)酶的最適條件分別為NaCl濃度5％，溫度37℃，pH8.0，轉(zhuǎn)速150rpm，裝樣量100ml/250ml(v/v)。部分酶學(xué)特性研究顯示，在含8％NaCl的0.05MTris-HCl(pH8.0)緩沖液中，50℃條件下

7、作用，酶活性最高;當(dāng)反應(yīng)液中金屬離子濃度為10mM時(shí)，Mg2+、Ca2+和Mn2+對(duì)酶活有激活作用，而Zn2+、Fe3+和Cu2+則對(duì)酶反應(yīng)有抑制作用;底物特異性實(shí)驗(yàn)表明，酶對(duì)碳原子數(shù)目＜10的對(duì)硝基苯酯類底物反應(yīng)特異性相對(duì)較高，而對(duì)碳原子數(shù)目＞10的底物反應(yīng)特異性很低，其中硝基苯棕櫚酸酯和橄欖油的酶活力幾乎為零，確定DF-B6菌株分泌的脂裂解酶為酯酶，而非脂肪酶。
　　 關(guān)鍵訶:酯酶;中度嗜鹽菌;非變性凝膠電泳;16SrRNA