肝癌生長、轉(zhuǎn)移中的微血管生成機(jī)制

1、<p>　　肝癌生長、轉(zhuǎn)移中的微血管生成機(jī)制</p><p>　　作者：李海民　趙愛志　竇科峰　李開宗　付由池 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 腫瘤轉(zhuǎn)移, </p><p>　　關(guān)鍵詞: 癌，肝細(xì)胞;毛細(xì)血管;腫瘤轉(zhuǎn)移 </p><p>　　摘 要:目的 研究微血管生成在肝癌、肝硬化、正常肝間的差異及其與肝癌生長、轉(zhuǎn)移

2、、病理特點(diǎn)的關(guān)系. 方法 用Ⅷ因子抗體和APA試劑盒對45例肝癌、21例肝硬化和8例正常肝的標(biāo)本行免疫組織化學(xué)染色，然后在200（×）顯微鏡下計(jì)數(shù)每一視野下的微血管數(shù)目. 結(jié)果 肝癌、肝硬化、正常肝組織的微血管數(shù)目分別是67.4±23.8，14.4±5.8和3.5±2.0，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三者相差顯著（P&lt;0.01），微血管數(shù)與肝癌的轉(zhuǎn)移、包膜形成相關(guān)，而與肝癌的大小、分級無關(guān).

3、結(jié)論 微血管生成在肝癌的轉(zhuǎn)移、包膜形成中具有重要的作用. </p><p>　　Abstract:AIM To investigate the difference and the mecha-nism of angiogenesis among hepatocellular carcinoma（HCC），cirrhosis and normal liver.METHODS With antibody ofⅧ

4、factor and APA kit，paraffin-embedded slides of45HCC，21cirrhosis and8normal liver were stainned，after which，mi-crovessel counting was performed.RESULTS The mi-crovessel density（MVD）of HCC，cirrhosis and normal liver was67.

5、4±23.8，14.4±5.8and3.5±2.0respectively.The difference was significant statistically.The MVD was corre-lated with th</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　腫瘤的血管生成被認(rèn)為是一個小的突變細(xì)胞群轉(zhuǎn)

6、化為一個大的、呈惡性生長并具有擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤的一個關(guān)鍵步驟［1］ .現(xiàn)在腫瘤的血管新生已被作為一個預(yù)后指標(biāo)廣泛用于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌等［2-7］ 腫瘤的研究，然而血管新生與肝癌病理特點(diǎn)，與正常肝和肝硬化之間的關(guān)系的研究，迄今為止很少.我們知道，肝癌是一個高血管質(zhì)的腫瘤，惡性程度較高，在血管造影中，肝癌大多表現(xiàn)出高血管質(zhì)的特點(diǎn)，因而，研究肝癌的血管生成與肝癌的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系將有重大意義. &l

7、t;/p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 Ⅷ因子抗體和APA試劑盒購自武漢博士德公司，45例肝癌標(biāo)本和21例肝硬化標(biāo)本均取自1994/1997年西京醫(yī)院手術(shù)切除、病理診斷明確的標(biāo)本，正常肝標(biāo)本取自尸檢標(biāo)本，常規(guī)連續(xù)切片，厚度0.5μm. </p><p>　　1.2 方法 采用卵白素-生物素（SA

8、BC）-過氧化酶免疫組織化學(xué)染色，操作步驟按試劑盒說明.結(jié)果判定微血管呈棕黃色，計(jì)數(shù)按Herbst等［3］ 人的方法進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)（microvessel density，MVD），由兩個人用雙筒顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，所要計(jì)數(shù)的微血管標(biāo)準(zhǔn)是:與臨近微血管或其連續(xù)組織分離的、陽性著色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞叢被認(rèn)為是一個獨(dú)立的可被計(jì)數(shù)的微血管.先用低倍鏡（50×）瀏覽整個切片，找出微血管密度最高的3個區(qū)域，再在這3個區(qū)域中用高倍鏡（200

9、×）隨機(jī)各選取1個高倍視野，行鏡下計(jì)數(shù)每一個高倍視野下的微血管數(shù)目，由兩個人各計(jì)數(shù)的3個高倍視野的微血管數(shù)取其平均值，此值代表整塊組織的微血管數(shù)，具有厚肌層的未被免疫組化著色的大血管，不在計(jì)數(shù)之列. </p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以x ±s表示，采用t檢驗(yàn). </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><

10、p>　　2.1 微血管密度與肝細(xì)胞肝癌病理特點(diǎn)之間的關(guān)系 肝癌內(nèi)微血管密度較高，微血管主要分布在腫瘤內(nèi)部（Fig1），由此可見，肝癌是一種高血管質(zhì)的腫瘤.一般來說，高密度區(qū)集中于腫瘤近周邊或近包膜處.壞死組織周圍微血管密度也較高，而腫瘤的中心及瘤外肝組織分布較少.微血管數(shù)波動于18～121（67.4±23.8）之間.微血管密度與包膜形成顯著相關(guān)，有包膜的腫瘤較無包膜的腫瘤具有較高的微血管密度.（t=1.84，P&

11、;lt;0.05）.本實(shí)驗(yàn)還提示微血管密度與腫瘤的轉(zhuǎn)移（包括肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，門靜脈侵犯或肝外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）顯著相關(guān).發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤，不論其體積大小，分化程度如何，有無包膜形成，均有較高的微血管密度.本研究提示在許多微血管中有單個或多個癌細(xì)胞侵犯，有的癌細(xì)胞恰好處于侵犯微血管壁的過程中（Fig2）.未發(fā)現(xiàn)微血管密度與腫瘤大小、分化程度之間的相關(guān)性（Tab1）. </p><p><b>　　圖1 －圖2 略 <

12、;/b></p><p>　　2.2 肝硬化、正常肝中的微血管新生 肝硬化和正 常肝的微血管密度明顯減少，比較而言，肝硬化的微血管密度較正常肝高，肝硬化的微血管密度波動于0～32.83之間（14.4±5.8），而正常肝的微血管密度波動于0～8.64之間（3.5±2.0），在肝硬化和正常肝中，微血管一般呈均勻分布，在炎癥細(xì)胞浸潤區(qū)，微血管密度相對較高（Tab2）. </p>

13、<p>　　表1 微血管密度與肝癌病理特點(diǎn)的關(guān)系　略 </p><p>　　表2 肝癌、肝硬化、正常肝微血管密度的比較　略 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　對于腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，血管新生是其必要的條件［8-11］ ，若沒有血管新生供給其迅速生長的瘤體以充足的營養(yǎng)，僅靠單純的組織液擴(kuò)散的方式維持其

14、營養(yǎng)供應(yīng)，腫瘤的直徑僅能保持在1～2mm，若較大的腫瘤一旦失去血液供應(yīng)，將會壞死、凋亡、處于休眠狀態(tài).許多研究表明，腫瘤的血管新生與其浸潤、轉(zhuǎn)移的潛能相關(guān).越來越多的證據(jù)表明，血管新生的誘導(dǎo)是腫瘤的一個具體的表型特征，是在腫瘤發(fā)展的早期，也就是在癌前病變時就已具有的特征，這在轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤形成和一些人類腫瘤的發(fā)展過程中也得到了證實(shí). </p><p>　　從腫瘤新生血管的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，腫瘤的新生血管利于腫瘤的生長、

15、浸潤和轉(zhuǎn)移，腫瘤的新生血管一般缺乏完整的血管壁，細(xì)胞間連接不緊密，連續(xù)性常遭破壞，基底膜不完整，腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)入新生血管，這就為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了便利條件.我們發(fā)現(xiàn)有的癌細(xì)胞恰好處于侵犯微血管壁的過程中，有的已侵入微血管內(nèi)，而且有的微血管內(nèi)可見多個癌細(xì)胞，由此可見，微血管的生成在腫瘤的轉(zhuǎn)移中具有不可低估的作用. </p><p>　　肝癌是一種多血管質(zhì)的腫瘤，可以想象，血管新生對其生存、發(fā)展是很重要的.然而，

16、近年來對血管新生與腫瘤關(guān)系方面的研究多集中在黑色素瘤、乳腺癌、直腸癌等腫瘤，而對肝癌的研究甚少.我們的研究發(fā)現(xiàn)，血管新生與肝癌的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P&lt;0.05），肝癌的轉(zhuǎn)移包括肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，門靜脈侵犯及肝外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而最多見的是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移.肝內(nèi)轉(zhuǎn)移可通過肝內(nèi)寄存于門靜脈、肝動脈分支形成，而新生血管的結(jié)構(gòu)缺陷不僅為其肝內(nèi)轉(zhuǎn)移提供了便利的途徑，而且為其肝外轉(zhuǎn)移打開了門戶.有研究表明，肝癌的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與其血管新生相關(guān)［12］ ，但對其機(jī)制的

17、研究僅限于假說，有待進(jìn)一步的研究闡明. </p><p>　　實(shí)體腫瘤是由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)兩部分組成的，血管就分布于間質(zhì)中.所以，間質(zhì)在腫瘤中的作用不僅僅是連接，更重要的是供給腫瘤以血液，使腫瘤細(xì)胞可以得到充足的養(yǎng)分，有效的氣體交換和廢物排出.纖維蛋白是形成間質(zhì)的前體，間質(zhì)的形成過程是肉芽組織以及隨后的成熟間質(zhì)逐漸代替纖維蛋白的過程.腫瘤細(xì)胞是不能產(chǎn)生纖維蛋白原的，所以，血管外纖維蛋白的沉積是來源于具有高度通透性的

18、微血管，而腫瘤的新生微血管由于其結(jié)構(gòu)上的不完整性以及一些細(xì)胞因子（如VEGF）的作用而具有了高通透性的特點(diǎn).因而微血管的高通透性被認(rèn)為是腫瘤中纖維蛋白沉積的主要原因之一［13］ .本研究中，近包膜區(qū)的微血管密度較高，與包膜形成顯著相關(guān).肝癌包膜形成的機(jī)制尚未闡明，有人認(rèn)為包膜是腫瘤的生長壓迫周圍間質(zhì)而形成的［14］ .然而，這一假說受到了質(zhì)疑，因?yàn)楦伟┑拇笮∨c包膜的形成及包膜的厚度均無關(guān)［15］ .這些發(fā)現(xiàn)提示，腫瘤包膜形成的原因更可能

19、是纖維蛋白的外滲而不是腫瘤生長對周圍間質(zhì)的壓迫. </p><p>　　我們的研究為微血管的高通透性在肝癌包膜形成中 的地位提供了有力的證據(jù). </p><p>　　靠近周邊部的微血管密度較高，其機(jī)制尚不清楚，可能與肝癌的浸潤有關(guān)，高密度的微血管能給周邊癌細(xì)胞提供更充足的養(yǎng)分，這就更加強(qiáng)了其浸潤能力.由于腫瘤的迅速生長，處于中心部位的肝癌細(xì)胞較周邊部位的肝癌細(xì)胞受到更大的壓力，所以，周邊部

20、位的肝癌細(xì)胞所處的寬松環(huán)境不僅有利于血管自寄存的血管床上萌芽、生長，而且為微血管新生所需的誘導(dǎo)因子在這種寬松環(huán)境下易于受趨化而到達(dá)血管新生部位創(chuàng)造了條件.所以，血管新生、腫瘤迅速生長、浸潤是相輔相成的.肝癌的浸潤可能需要微血管的支持，以提供營養(yǎng)或其他必要的細(xì)胞因子以降解基質(zhì)，破壞正常肝細(xì)胞，這可能是微血管高密度區(qū)位于腫瘤周邊的一個原因.在壞死灶周邊，微血管密度相對增高，這可能與壞死后缺氧有關(guān).目前已知缺氧可觸發(fā)血管生成因子的釋放，誘導(dǎo)微

21、血管生成.然而在肝癌的中心部位，微血管密度較低，從這一現(xiàn)象來看，缺氧在肝癌微血管新生中的地位可能不是主要的.因?yàn)樯飫恿W(xué)研究表明，由于腫瘤的迅速生長，其中心部位的壓力較大，細(xì)胞也較密集，相對于外周的癌細(xì)胞來說，缺氧更趨嚴(yán)重，而處于周邊部的腫瘤細(xì)胞，不僅所受壓力小，細(xì)胞較松散，而且可以從瘤外彌散過來的組織液中獲取營養(yǎng)，所以其缺氧程度</p><p>　　另外，在肝硬化標(biāo)本中微血管密度較肝癌顯著降低，而高于正常肝.

22、國內(nèi)的肝硬化大多伴有乙型或丙型肝炎，炎癥介質(zhì)中包含有許多可以直接誘導(dǎo)血管新生的細(xì)胞因子，如IL-8，TNF-α，TGF，bFGF，VEGF等，這些因子還可間接地或誘發(fā)其他更強(qiáng)的促血管生成因子而協(xié)同作用于微血管的生成.而且肝硬化存在廣泛的纖維化，血管經(jīng)纖維條索壓迫后扭曲，血運(yùn)不暢，肝血竇受壓，所以與正常肝相比，存在缺氧情況，肝硬化炎癥介質(zhì)的釋放，細(xì)胞因子的作用及缺氧共同促成了微血管的新生.這可以說明，在肝硬化、正常肝中，微血管多集中在炎癥

23、細(xì)胞聚集的區(qū)域.就國內(nèi)而言，肝癌多伴有肝硬化，而若肝硬化的微血管密度在某個區(qū)域顯著升高，則可能是下一步癌變的前奏，由原位癌到浸潤癌的發(fā)展必須克服的一個難關(guān)就是微血管新生. </p><p>　　從本研究可以看出，微血管生成與肝癌的轉(zhuǎn)移、浸潤有關(guān)，而與腫瘤的分級、大小無關(guān)，現(xiàn)在對這方面的研究在國外也才剛起步，得出的結(jié)果往往不太相符，其具體原因有待進(jìn)一步闡明.徹底弄清微血管生成與腫瘤病理特點(diǎn)之間的關(guān)系必將為腫瘤的抗血

24、管治療提供新的理論依據(jù). </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Folkman J.Fighting cancer by attacking its blood supply ［J］.Sci Am，1996;275（3）:150-154. </p><p>　　［2］Kato T，Kameoka S，K

25、imura T，Nishikawa T，Kasajima T.Angiogenesis and blood vessel invasion as prognostic indicators for node-negative breast cancer ［J］.Breast Cancer Res Treat，2001;65（3）:203-215. </p><p>　?。?］Herbst RS，F(xiàn)idler IJ

26、.Angiogenesis and lung cancer:Potential for therapy ［J］.Clin Cancer Res，2000;6（12）:4604-4606. </p><p>　?。?］Dutcher JP.Angiogenesis and melanoma ［J］.Curr Oncol Rep，2001;3（4）:353-358. </p><p>　?。?

27、］Forootan SS，Ke Y，Jones AS，Helliwell TR.Basic fibroblast growth factor and angiogenesis in squamous carcinoma of the tongue ［J］.Oral Oncol，2000;36（5）:437-443. </p><p>　?。?］Abdulkadir SA，Carvalhal GF，kaleem Z

28、，Kisiel W，HumphreyPA，Catalona WJ，Milbrandt J.Tissue factor expression and angiogenesis in human prostate carcinoma ［J］.Hum Pathol，2000;31（4）:443-447. </p><p>　?。?］Brown MR，Blanchette JO，Kohn EC.Angiogenesis

29、in ovarian cancer ［J］.Baillieres BestPractRes Clin ObstetGynaecol，2000;14（6）:901-918. </p><p>　?。?］Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent ［J］?J Natl Cancer Inst，1990;2（1）:4-6.

30、</p><p>　?。?］Liu DH，Zhang XY，Huang YX，F(xiàn)an DM.VEGF165 antisense gene and biological characteristics of human gastric cancer cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（9）:821-824. </p

31、><p>　?。?0］Liu CL，Dou KF，Li B.Expression and significance of vascular endothelial growth factor and it’s receptors in hepatocellular car-cinoma cell lines ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），200

32、0;21（6）:770-772. </p><p>　?。?1］Liu F，Zhang X，Bu XY，Yi SY，Zhang JN，Guo QD，Liu XZ，Song SJ.Tumor angiogenesis in meninginoma in relation to peri-tumoral edema，recurrence and prognosis ［J］.Di-si Junyi Dax-ue Xue

33、bao（J Fourth Mil Med Univ）.2000;21（9）:1153-1155. </p><p>　?。?2］Osama N，El-Assal，Akira Y，Bru C.Clinical significance of microvessel density and vascular endothelial growth factor ex-pression in hepatocellular

34、 carcinoma and surrounding liver:Pos-sible involvement of vascular endothelial growth factor in the an-giogenesis of cirrhotic liver［J］.Hepatology，1998;27（6）:1554-1562. </p><p>　?。?3］Senger DR，Van De Water L

35、，Brown LF.Vascular permeabili-ty factor in tumor biology ［J］.Cancer Metastasis Rev，1993;12（3-4）:303-324. </p><p>　?。?4］Nakashima T，Okuda K，Kojiro M，Jimi A，Yamaguchi R，Sakamoto K，Ikari T.Pathology of hepatoce

36、llular carcinoma in Japan.232consecutive cases autopsied in ten years ［J］.Cancer（Phila.），1983;51:863-877. </p><p>　?。?5］Irene OL，Path MRC，Lai ECS，Ng IO，Lai EC，Ng MM，F(xiàn)an ST.Tumor encapsulation in hepatocellul