新基因CIAPIN1在胃癌轉(zhuǎn)移及血管生成中的作用及機制研究.pdf

1、胃癌目前為止仍然是世界上公認的威脅人類健康的問題之一，盡管近年來胃癌在西方國家發(fā)病率已明顯下降，但多數(shù)胃癌患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期并發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機會，轉(zhuǎn)移仍是其致死的主要原因，影響患者的生活質(zhì)量及預后。胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的本性由一系列分子事件決定，包括多種癌基因及抑癌基因的突變，生長因子及其受體異常表達等，是多基因參與、多種信號轉(zhuǎn)導蛋白的調(diào)控及多步驟協(xié)同的復雜網(wǎng)絡過程，從而導致控制腫瘤生物學行為的下游信號轉(zhuǎn)導分子的表達，增強胃癌細胞誘生血管

2、生成的能力。其發(fā)生機制尚未闡明，需要進一步深入研究。
　　細胞因子誘導的凋亡抑制因子1（Cytokine-induced apoptosis inhibitor1，CIAPIN1）在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CIAPIN1與多種腫瘤的耐藥、增殖、預后密切相關(guān)。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)CIAPIN1在胃癌組織中低表達，參與胃癌的增殖與多藥耐藥的調(diào)控，可能作為多個信號通路中的關(guān)鍵分子參與胃癌發(fā)生發(fā)展的多個過程。但CIAPIN1在

3、胃癌轉(zhuǎn)移及血管生成中的作用以及分子機制還未見報道，需要我們深入探討。因此，研究CIAPIN1在胃癌轉(zhuǎn)移及血管生成中的作用及分子機制，可為深入理解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子事件提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.觀察 CIAPIN1在臨床組織標本中的表達水平與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成的相關(guān)性；
　　2.體外實驗觀察CIAPIN1對胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成的調(diào)控作用；
　　3.初步探討CIAPIN1介導胃癌血管生成的可能分子

4、機制。
　　方法：
　　1.免疫組織化學方法檢測 CIAPIN1在正常胃黏膜組織、轉(zhuǎn)移胃癌以及非轉(zhuǎn)移胃癌組織組織中的表達變化，Chi-square test統(tǒng)計分析CIAPIN1與胃癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；
　　2.免疫組織化學方法檢測CIAPIN1、VEGF以及CD31-MVD在胃癌及癌旁組織中的表達，Chi-square test統(tǒng)計分析CIAPIN1和VEGF的表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，Sperman分析CIA

5、PIN1和VEGF的表達及CD31-MVD計數(shù)之間的相關(guān)性，分析CIAPIN1與胃癌血管生成的相關(guān)性；
　　3.構(gòu)建CIAPIN1正義真核表達載體及特異性siRNA表達載體，并分別將其以及相應對照空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞系，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，利用Western-blot及RT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率；
　　4通過細胞Transwell實驗從體外功能學證實CIAPIN1對胃癌細胞侵襲、遷移的作用，觀察

6、CIAPIN1對胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用；
　　5采用腫瘤條件培養(yǎng)基法建立Co-HUVECs細胞，利用MTT細胞增殖實驗、細胞化學粘附實驗、細胞遷移實驗觀察CIAPIN1對HUVEC細胞的增殖、粘附、運動遷移的作用，利用體外小管形成實驗（tube formation assay）觀察CIAPIN1對胃癌細胞誘生血管生成能力的影響；
　　6收集高/低表達CIAPIN1的胃癌SGC-7901細胞系的蛋白，Western-blot檢測血

7、管生成相關(guān)分子：VEGF，CDC42，HIF-1α，IL-6，IL-8，探討CIAPIN1調(diào)控胃癌血管生成的可能分子機制。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示：CIAPIN1在胃癌組織中的表達水平顯著低于其對應的癌旁組織(P=0.0008)；發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織中CIAPIN1表達低于其在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達水平(P＜0.0001)；此外，CIAPIN1的表達與胃癌的TNM分期密切相關(guān)(P=0.0037)；
　

8、　2. VEGF在胃癌組織中的表達顯著高于其在癌旁組織中的表達水平(P＜0.0001)，在胃癌組織中表達的陽性率為68％，VEGF的表達與患者腫瘤分化程度密切相關(guān)(P=0.0042)；此外，胃癌組織的 CD31-MVD計數(shù)（55.82±3.344）顯著高于癌旁組織的CD31-MVD計數(shù)（12.16±1.211）(P＜0.0001)。進一步Sperman等級相關(guān)性分析顯示CIAPIN1的表達與VEGF的表達以及CD31-MVD計數(shù)成負相關(guān)

9、；
　　3 Western-blot以及 RT-PCR實驗結(jié)果均顯示正義真核表達載體pcDNA3.1-CIAPIN1可以上調(diào) CIAPIN1在胃癌 SGC-7901細胞系中的表達，相反特異性psi?CIAPIN1-2載體可以顯著抑制胃癌SGC-7901細胞系中內(nèi)源性CIAPIN1的表達；
　　4.轉(zhuǎn)染正義真核表達CIAPIN1載體后，胃癌SGC-7901侵襲、遷移細胞數(shù)顯著少于對照組，而轉(zhuǎn)染特異性siRNA的質(zhì)粒載體后SGC

10、-7901侵襲、遷移細胞數(shù)顯著多于對照組（P＜0.05）；
　　5.建立Co-HUVECs細胞，CIAPIN1過表達時，HUVEC細胞增殖減慢、細胞粘附數(shù)及遷移數(shù)減少，體外小管形成實驗顯示 HUVEC細胞形成小管的長度及數(shù)量均低于對照組；下調(diào) CIAPIN1表達得到類似的結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　　6. Western-blot實驗顯示：抑制CIAPIN1在胃癌SGC-7901細胞內(nèi)表達可上調(diào)CDC42

11、、VEGF、HIF-1α、IL-8等血管生成相關(guān)分子的表達。
　　結(jié)論：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示新基因CIAPIN1在胃癌組織中表達水平顯著低于正常胃黏膜組織，在轉(zhuǎn)移的胃癌組織表達水平顯著低于非轉(zhuǎn)移胃癌組織及正常胃黏膜組織，CIAPIN1在胃癌組織中的表達水平與VEGF的表達水平及 CD31-MVD計數(shù)成負相關(guān)，提示CIAPIN1與胃癌的轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)；
　　2.體外細胞實驗發(fā)現(xiàn) CIAPIN1可抑制胃癌 S

12、GC-7901細胞的侵襲、遷移和HUVEC細胞的增殖、粘附、遷移及小管形成，提示 CIAPIN1可抑制胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成，可能在胃癌轉(zhuǎn)移及血管生成過程中發(fā)揮重要作用；
　　3. Western-Blot結(jié)果顯示CIAPIN1可抑制CDC42、VEGF、HIF-1α、IL-8等血管生成相關(guān)分子的表達水平，提示CIAPIN1可抑制胃癌血管生成，其機制部分是通過抑制HIF-1α和VEGF的表達來實現(xiàn)的。
　　CIAPI

13、N1作為一個凋亡相關(guān)新基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，我科既往研究發(fā)現(xiàn)CIAPIN1調(diào)控胃癌增殖和耐藥，但其介導胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成的作用尚未見報道，本研究首次發(fā)現(xiàn) CIAPIN1與胃癌轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)，其抑制血管生成的機制部分是通過抑制HIF-1α和VEGF的表達來實現(xiàn)的；并可能存在兩條信號通路，一是 CIAPIN1直接作用于 VEGF從而發(fā)揮抑制胃癌血管生成的作用，二是 CIAPIN1通過對 HIF-1α作用之后間