rt-pcr檢測(cè)穹窿海馬傘切割后大鼠海馬內(nèi)lhx8 mrna的表達(dá)變化

1、<p>　　RT-PCR檢測(cè)穹窿海馬傘切割后大鼠海馬內(nèi)Lhx8 mRNA的表達(dá)變化</p><p>　　作者：秦建兵，金國(guó)華，蔣媛媛，王 磊，朱蕙霞，田美玲，張新化</p><p>　　【摘要】 　　目的：探討切割穹隆海馬傘大鼠海馬與正常海馬內(nèi)Lhx8 mRNA表達(dá)的差異。方法：36只SD大鼠隨機(jī)分成6組，每組6只。1組為正常對(duì)照組，其余5組分別為切割穹窿海馬傘后3、7、14、

2、21和28 d組。取各組大鼠的海馬組織，提取總RNA，采用半定量RT-PCR法分析穹隆海馬傘切割后海馬內(nèi)Lhx8 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：海馬內(nèi)Lhx8 mRNA的表達(dá)量在切割后第3 d開始升高，7 d時(shí)達(dá)到最高水平，以后逐漸下降，于28 d時(shí)恢復(fù)至正常水平。結(jié)論：切割穹窿海馬傘后海馬中Lhx8 mRNA表達(dá)的增高可能與神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化的再生機(jī)制有關(guān)。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 穹窿海馬傘

3、切割 海馬 Lhx8 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng) 大鼠</p><p>　　[Abstract] Objective: To observe the difference of Lhx8 mRNA expression in hippocampi between the fimbria fornix transected rats and normal ones. Methods: 36 SD rats were

4、randomly divided into 6 groups, 6 rats in each group. Group one was the control group, and the others were 3rd, 7th, 14th, 21st and 28th day group after fimbria fornix transected. Then hippocampi were isolated and total

5、RNA was extracted. Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis was </p><p>　　[Key words] Fimbria fornix transection; Hippocampus; Lhx8; Reverse transcription-polymer

6、ase chain reaction; Rat</p><p>　　移植于切割穹窿海馬傘齒狀回中的神經(jīng)干細(xì)胞較正常側(cè)海馬齒狀回中植入的神經(jīng)干細(xì)胞更易于存活、遷移和向神經(jīng)元分化[1,2]。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)切割穹窿海馬傘的海馬提取液能明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和膽堿能分化[3]。這些結(jié)果提示切割穹窿海馬傘后海馬中某些能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞存活、遷移和向神經(jīng)元分化的信號(hào)物質(zhì)表達(dá)增高。Lhx8是LIM同源盒基因家族中的一員，它主

7、要選擇性的表達(dá)在MGE(medial ganglionic eminence, MGE)區(qū)，對(duì)于膽堿能神經(jīng)元的分化有至關(guān)重要的作用[4]。但迄今為止Lhx8基因在病理模型中的表達(dá)研究仍是空白。本研究旨在觀察切割穹窿海馬傘后大鼠海馬內(nèi)Lhx8 mRNA表達(dá)是否增高，以推測(cè)Lhx8與切割穹窿海馬傘海馬促進(jìn)移植入其中的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元或膽堿能神經(jīng)元分化關(guān)系。</p><p><b>　　1 材料和方法&

8、lt;/b></p><p>　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠36只（南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不拘，體重220～250 g，隨機(jī)分成6組，其中1組為正常對(duì)照組，其余5組分別為手術(shù)后3、7、14、21和28 d組，每組6只。</p><p>　　1.2 切割大鼠穹窿海馬傘 上述各手術(shù)組SD大鼠，經(jīng)腹腔注射復(fù)合麻醉劑Chlorpent（0.2 ml/100 g）麻醉

9、后，固定于立體定位儀，暴露前囟，確定前囟坐標(biāo)A(矢狀軸)、L(冠狀軸)、V(垂直軸)，根據(jù)Paxinos圖譜確定左右兩側(cè)穹隆海馬傘的切割范圍。先在顱骨上確定右側(cè)兩點(diǎn)即：（1）A1=A－1.4、L1＝L－4和；（2）A2＝A－1.4、L2＝L－4；左側(cè)兩點(diǎn)即；（3）A3=A－1.4、L3＝L＋1和（4）A4＝A－1.4、L4＝L＋4，每點(diǎn)各鉆一小孔，用刀片將右側(cè)（1）和（2）、左側(cè)（3）和（4）點(diǎn)間顱骨劃開一條骨縫，將針刀插入腦內(nèi)至切割深

10、度即V1－4＝V+5.4，來回切割3次，退出針刀，待無顱內(nèi)出血后用骨蠟封閉骨縫，縫合皮膚，肌注青霉素，動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)。</p><p>　　1.3 RNA的提取和保存 正常組及手術(shù)后各組大鼠經(jīng)上述方法麻醉后，斷頸處死，無菌條件下剝?nèi)ワB骨和硬腦膜，再去除大腦皮質(zhì)和胼胝體，證實(shí)兩側(cè)穹窿海馬傘被切斷后，取出兩側(cè)海馬組織，用Trizol法提取RNA，沉淀用50 μl DEPC-H2O溶解。取少量樣品進(jìn)行紫外定

11、量，用甲醛變性電泳鑒定RNA質(zhì)量，其余樣品保存于－70 ℃冰箱中備用。</p><p>　　1.4 半定量RT-PCR 選用磷酸甘油醛脫氫酶 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參照。反應(yīng)中所用GAPDH上游引物為：5'-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3'，下游引物為：5'-TCCACCACCCTGTTG

12、CTGTA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為452 bp；Lhx8上游引物為：5'-ATGTATTGGAAGAGCGATCAG-3'，下游引物為：5'-TCATTGGATGGGG TAACAAGGGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為1102 bp。GAPDH和Lhx8的cDNA序列查自GenBank，引物由上海英駿公司合成。PCR反應(yīng)：將目的基因與內(nèi)參基因的引物置同一管內(nèi)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系按試劑DNA聚合酶(MBI公司)說

13、明書操作。預(yù)變性94 ℃、3 min，然后94 ℃、45 s，60 ℃、30 s，72 ℃、65 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析，捷達(dá)圖像分析系統(tǒng)對(duì)凝膠各泳道中的GAPDH和Lhx8條帶進(jìn)行光密度掃描。</p><p>　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以各泳道中Lhx8與GAPDH條帶的光密度比值表示Lhx8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，建立相對(duì)表達(dá)量柱形圖。數(shù)據(jù)輸入

14、Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)（SNK法）。</p><p>　　2 結(jié) 果</p><p>　　2.1 RNA分析 3 μl RNA樣品經(jīng)甲醛－瓊脂糖凝膠變性電泳，120 V電壓電泳25 min，紫外燈下觀察到28 S RNA∶18 S RNA約為1.5∶1，5 S RNA呈淡云霧狀，表明樣品為RNA，且無降解。另

15、取樣品在蛋白核酸測(cè)定儀上檢測(cè)OD值，各組OD260/OD280均在1.8~2.0，說明所提取的RNA純度較高，無污染。</p><p>　　2.2 半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，以DL-2000 DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增產(chǎn)物及內(nèi)參大小與預(yù)期結(jié)果相符（分別為1102 bp和452 bp）。穹隆海馬傘切割后不同時(shí)間點(diǎn)Lhx8 mRNA相對(duì)表達(dá)量如圖2所示。方差分析和均數(shù)兩兩

16、比較表明，切割后28 d組與正常對(duì)照組相比，Lhx8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&gt;0.05)，3 d、7 d、14 d和21 d組與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&lt;0.05)；比較切割后不同時(shí)間組，各組間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&lt;0.05)。說明Lhx8 mRNA表達(dá)量自切割后第3 d開始升高，7 d時(shí)達(dá)到最高水平，以后開始下降，于28 d左右恢復(fù)至正常水平。</

17、p><p>　　3 討 論</p><p>　　3.1 Lhx8基因與膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育 神經(jīng)干細(xì)胞以其自我更新、增殖和多向分化潛能等特性已經(jīng)成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病的理想細(xì)胞材料。如何調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元尤其是向特定表型的神經(jīng)元(如膽堿能、多巴胺能等神經(jīng)元)分化，已成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Lhx8[4]是最近新鑒定的LIM同源盒基因家族中的成員之一，

18、又稱為L(zhǎng)3、Lhx7，特異性地在胚胎基底前腦和口腔間質(zhì)中表達(dá)。Zhao等定向敲除小鼠Lhx8基因后發(fā)現(xiàn)膽堿能標(biāo)記的神經(jīng)元減少，從而發(fā)現(xiàn)Lhx8在膽堿能神經(jīng)元的分化中起積極的作用[4]。Manabe等利用RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)Lhx8的選擇性定位和它的功能性配體對(duì)于基底前腦中的膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育有重要作用[5]。關(guān)于Lhx8在病理狀態(tài)下的腦組織如切割穹窿海馬傘后的海馬中表達(dá)的變化，以及在穹窿海馬傘切割后的海馬膽堿能神經(jīng)元的再生中是否扮演著重要

19、角色則尚未見有報(bào)道。</p><p>　　3.2 切割穹窿海馬傘海馬中Lhx8 mRNA的上調(diào)可能與膽堿能神經(jīng)再生有關(guān) 穹窿海馬傘中不僅含有海馬錐體細(xì)胞層和齒狀回顆粒層細(xì)胞投射至丘腦前核、乳頭體核、隔外側(cè)核及斜角帶核的傳出纖維，而且還含有基底前腦內(nèi)側(cè)隔核和斜角帶垂直支投射到海馬的膽堿能傳入纖維[6,7]。內(nèi)側(cè)隔核的膽堿能神經(jīng)元發(fā)出纖維經(jīng)海馬傘和背側(cè)穹窿這一隔-海馬通路與海馬結(jié)構(gòu)建立廣泛的聯(lián)系，這一膽堿能投

20、射系統(tǒng)被認(rèn)為與學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能密切相關(guān)[8]。穹窿海馬傘切斷后，阻斷了隔區(qū)等相關(guān)經(jīng)穹窿海馬傘投射到海馬的膽堿能神經(jīng)纖維，使該側(cè)海馬失去了膽堿能神經(jīng)支配，導(dǎo)致乙酰膽堿缺失，使得海馬內(nèi)的微環(huán)境發(fā)生變化，而引起切割側(cè)海馬中某些物質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)，而這些物質(zhì)對(duì)激活自體的神經(jīng)干細(xì)胞或植入的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元或膽堿能神經(jīng)元分化起到了促進(jìn)作用[2]。結(jié)合本課題組此前研究的結(jié)果，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)切割側(cè)海馬Lhx8 mRNA的表達(dá)上調(diào)，除了可能是切割穹窿海馬傘后

21、海馬中的細(xì)胞對(duì)抗損傷的一種反應(yīng)外，更可能是海馬中啟動(dòng)了膽堿能神經(jīng)再生機(jī)制，是對(duì)抗海馬內(nèi)乙酰膽堿遞質(zhì)缺失后的一種反應(yīng)。但究竟是變化了微環(huán)境中的哪些物質(zhì)，通過什么信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起Lhx8 m</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　[1] 金國(guó)華,張新化,田美玲,等. 大鼠海馬內(nèi)移植神經(jīng)干細(xì)胞的存活和遷移[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2003,

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