斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體ScFv的構(gòu)建及活性檢測.pdf

1、近年來，單鏈抗體技術(shù)的發(fā)展非常迅速，并被廣泛地應(yīng)用于人類疾病的研究中，但是在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用卻鮮有報導(dǎo)。本論文的目的是構(gòu)建斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體，并對其原核表達(dá)產(chǎn)物與溶藻弧菌的結(jié)合活性進(jìn)行檢測。本實驗設(shè)計引物所用的序列來自實驗室構(gòu)建的經(jīng)溶藻弧菌感染后的斜帶石斑魚外周血淋巴以及頭腎Smart cDNA文庫，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)的大量的免疫球蛋白重鏈與輕鏈的基因，這為斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體的構(gòu)建提供了豐富的材料，通過對測序得到的免疫球蛋

2、白可變區(qū)序列進(jìn)行分析，根據(jù)其可變區(qū)的框架一區(qū)(FR1)和框架四區(qū)(FR4)篩選出一類豐度較高的重鏈的可變區(qū)(VH)與輕鏈的可變區(qū)(VL)基因序列，并分別按照這兩類序列的框架一區(qū)(FR-1)和框架四區(qū)(FR4)設(shè)計引物進(jìn)行VH、VL的擴增，在Vn的5’端、VL的3’端分別加上Nde I和Xho I酶切位點以便與表達(dá)載體pET-21a連接，中間以一段柔和的多肽(Gly4Ser)3(linker)按Vx-linker-VL的形式連接后構(gòu)建抗溶

3、藻弧菌的單鏈抗體(SeFv)的原核表達(dá)質(zhì)粒pET21a-S，經(jīng)測序后得到ScFv基因序列全長705堿基對，編碼235個氨基酸，符合魚類免疫球蛋白可變區(qū)基因的特征，含有框架區(qū)(FRs)、抗原互補區(qū)(CDRs)以及免疫球蛋白特征性的半胱氨酸殘基，證明ScFv基因構(gòu)建成功，于是用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并在37℃、28℃、16℃分別進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果顯示在三個溫度下ScFv均以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)，分子量為24.8k

4、Da；所得蛋白純化后，用ELISA進(jìn)行抗原結(jié)合活性檢測其效價為1:3200；隨后再用表達(dá)的ScFv蛋白與佐劑混合后對體重約2kg的新西蘭大白兔進(jìn)行免疫制備多克隆抗體，免疫程序結(jié)束后抽血并分離血清，檢測血清中抗ScFv的多克隆抗體的效價為1:10000. 本實驗成功構(gòu)建了斜帶石斑魚抗溶藻弧菌單鏈抗體ScFv，并成功進(jìn)行了原核表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的純化，用ELISA檢測了ScFv與抗原(溶藻弧菌)的結(jié)合活性，其結(jié)果顯示ScFv與溶藻弧菌