藏藥獨一味兩種方法提取組分對小鼠鎮(zhèn)痛作用的影響

1、<p>　　藏藥獨一味兩種方法提取組分對小鼠鎮(zhèn)痛作用的影響</p><p>　　作者：林天慕，顧宜，方坤泉，張三奇，蔣永培 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 獨一味 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To explore an experimental method for the study of effective com

2、ponents in traditional Chinese medicine by chemical separation technology integrated with pharmacological experimentation. METHODS: Lamiophlomis rotata, a medicinal plant in Tibet, was chosen in our study and different

3、compounds were separated by two methods: extraction with solvent and gradient elution with macroporous adsorptive resin. Effective components of analgesic were screened by acetic acid writhing and </p><p>　　

4、【Keywords】 Lamiophlomis rotata(Benth.)kudo ; extraction components; analgesia </p><p>　　【摘要】 目的： 中藥化學(xué)提取分離技術(shù)與藥理學(xué)試驗方法相結(jié)合，構(gòu)建中藥有效成分研究的實驗方法. 方法： 以獨一味為代表藥物，采用溶劑萃取法及大孔吸附樹脂梯度洗脫分離法兩種方法制備樣品，通過小鼠醋酸扭體法及熱板法篩選鎮(zhèn)痛有效部位. 結(jié)果

5、： 兩種方法提取分離的樣品對醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)有明顯的抑制作用；大孔吸附樹脂梯度洗脫法分離的樣品能明顯延長小鼠熱板的痛閾時間. 萃取法中鎮(zhèn)痛有效物質(zhì)主要集中在正丁醇部分、石油醚部分、水部分；大孔吸附樹脂梯度洗脫分離法中主要集中在300 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分、900 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分和沉淀物部分. 結(jié)論： 初步建立了中藥有效部位的研究方法，找到了獨一味中鎮(zhèn)痛有效部位. <

6、/p><p>　　【關(guān)鍵詞】 獨一味；提取組分；鎮(zhèn)痛 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　我國擁有極其豐富的中藥資源，卻難以走向世界，參與國際競爭. 關(guān)鍵缺乏現(xiàn)代技術(shù)手段來說明中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，缺乏嚴(yán)格的、明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn). 以往對中藥的研究過于片面，或側(cè)重于化學(xué)成分研究，或側(cè)重于藥效研究. 忽視了化學(xué)成

7、分與藥效之間的相關(guān)性. 因此，我們擬建立中藥有效成分研究的實驗方法，通過化學(xué)分離方法將中藥中所有化學(xué)組分分成幾部分，并結(jié)合藥效試驗篩選出有效部位，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制. </p><p>　　獨一味Lamiophlomis rotata(Benth.)kudo是我國藏、蒙、納西等民族民間常用草藥之一，《中國藥典》2000版一部收載獨一味膠囊. 臨床主要用于多種外科手術(shù)后的刀口疼痛、出血，外傷骨折，筋骨扭傷，風(fēng)濕

8、痹痛等癥［1］. 獨一味中已分得的化學(xué)成分主要有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂甙類等［2-4］. 已有報道獨一味浸膏具有鎮(zhèn)痛活性［5］，而對獨一味鎮(zhèn)痛有效部位的研究未見報道. 因此. 我們以獨一味為代表藥物，用不同提取分離方法對獨一味的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分離，通過藥效試驗初步確定了鎮(zhèn)痛有效部位. 為進(jìn)一步研究其鎮(zhèn)痛有效單體及鎮(zhèn)痛機(jī)制奠定基礎(chǔ). </p><p><b>　　1材料和方法 </b>

9、</p><p>　　1.1材料獨一味藥材，采自四川藏區(qū)，經(jīng)鑒定為唇形科獨一味屬植物獨一味全草Lamiophlomis rotata(Benth.)kudo；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、醋酸均為分析純；酮洛芬（ketoprofen，浙江湖州市合成藥廠，010901），吐溫80（上海申隆藥業(yè)，990602）；昆明種小鼠，體質(zhì)量18~22 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供（陜醫(yī)動字第08-13號）；D101大孔

10、樹脂（購自西安藍(lán)深公司）；自動恒溫小鼠熱板法實驗裝置一套［自制,(55±0.2)℃］. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1溶劑萃取法分離樣品稱取獨一味藥材粗粉200 g，加950 mL&#12539;L-1乙醇回流提取3次，第一次10倍量溶劑，回流2 h，第二次和第三次8倍量溶劑，回流1.5 h. 合并

11、提取液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味，得100 mL濃縮液. 濃縮液加1倍量水混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取. 分別萃取3次，每次100 mL，合并萃取液，回收溶劑至干. 得樣品石油醚部分6.6 g（A）、乙酸乙酯部分1.2 g（B）、正丁醇部分8.5 g（C）、萃取剩余部分為水部分24.1 g（D）. 以254 mL 20 mL&#12539;L-1吐溫80溶解，為母液備用. </p><p>

12、　　1.2.2大孔吸附樹脂梯度洗脫法分離樣品稱取獨一味藥材粗粉200 g，置滲漉器內(nèi)，800 mL&#12539;L-1乙醇浸泡過夜后開始收集滲漉液. 至流出液薄層層析（TLC）檢測無斑點為止. 減壓濃縮滲漉液，回收乙醇至無醇味，加1倍量水混懸，靜置過夜，析出油脂狀沉淀物，減壓抽濾，得油脂狀沉淀物5.8 g（E）. 濾液濃縮至50 mL，經(jīng)大孔吸附樹脂柱，以蒸餾水、100， 300， 500， 700和900 mL&#1

13、2539;L-1乙醇水溶液梯度洗脫. 經(jīng)TLC檢測，合并相似部分，得水洗脫部分8.2 g（F）、100 mL&#12539;L-1與300 mL&#12539;L-1部分合并為300 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分15.6 g（G）、其余部分合并為900 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分6.7 g（H）. 以1810 mL 20 mL&#12539;L-1吐溫80溶解，母液備用.

14、</p><p>　　1.2.3醋酸扭體法取小白鼠132只，隨機(jī)分為12組，每組10~12只，♀、♂各半，分別ig 20 mL&#12539;L-1吐溫80（20 g&#12539;kg-1,陰性對照組）、酮洛芬（5 mg&#12539;kg-1，陽性對照組）、樣品A（130 mg&#12539;kg-1）、樣品B（24 mg&#12539;kg-1）、樣品C（170 mg

15、&#12539;kg-1）、樣品D（480 mg&#12539;kg-1）及樣品E（16 mg&#12539;kg-1）、樣品F（22 mg&#12539;kg-1）、樣品G（42 mg&#12539;kg-1）、樣品H（18 mg&#12539;kg-1）. 給藥后1 h，各組小鼠分別腹腔注射6 mL&#12539;L-1醋酸溶液10 mL&#12539;kg-1,給醋酸

16、后立即計時，記錄小鼠開始扭體時間及5～15 min內(nèi)扭體次數(shù). </p><p>　　1.2.4熱板法選痛閾值在5~30 s的雌性小白鼠144只，隨機(jī)分為12組，每組12只. 給藥前測各鼠痛閾值兩次，取均值，分別ig 20 mL&#12539;L-1吐溫80（20 g&#12539;kg-1,陰性對照組）、酮洛芬（20 mg&#12539;kg-1，陽性對照組）、樣品A(520 mg&am

17、p;#12539;kg-1)、樣品B (96 mg&#12539;kg-1)、樣品C(680 mg&#12539;kg-1)、樣品D(1920 mg&#12539;kg-1)及樣品E(64 mg&#12539;kg-1)、樣品F(88 mg&#12539;kg-1)、樣品G(168 mg&#12539;kg-1)、樣品H(72 mg&#12539;kg-1). 于ig后1, 2和3

18、 h分別測定各鼠痛閾值兩次，取均值. 紀(jì)錄結(jié)果. </p><p>　　統(tǒng)計方法：所有試驗數(shù)據(jù)用x±s表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進(jìn)行方差分析及Dunnett t檢驗，對于方差不齊的資料，應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗進(jìn)行組間比較. </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1對醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)的影響樣品

19、A, B, C, D, E, F及G, H結(jié)果見Tab 1. 結(jié)果顯示，兩種方法分離的樣品中，萃取法中石油醚萃取部分、正丁醇萃取部分、水部分；大孔吸附樹脂分離法中沉淀物部分、水洗脫部分、300 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分、900 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分均可顯著減少小鼠扭體次數(shù)（Tab 1）. 正丁醇萃取部分明顯延遲小鼠扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時間（P&lt;0.05），其他各組分對扭體出現(xiàn)時間無

20、影響. </p><p>　　表1獨一味溶劑萃取法和大孔樹脂法分離樣品對小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響（略） </p><p>　　Tab 1Analgesic effects of samples separated by extraction with solvent from Lamiophlomis and gradient elution with macroporous adsorpt

21、ive resin on the writhing reaction induced by acetic acid in mice(略) </p><p>　　2.2對小鼠熱板法痛閾的影響結(jié)果見Tab 2. 結(jié)果顯示，萃取法中水部分組藥后1, 2及3 h，大孔吸附樹脂分離法中沉淀物部分和900 mL&#12539;L-1乙醇部分藥后2 h, 3 h及300 mL&#12539;L-1乙醇部分藥后

22、3 h均能明顯提高小鼠痛閾值（Tab 2）. 萃取法中其他組分，以及大孔吸附樹脂分離法中水洗脫部分3 h內(nèi)對小鼠痛閾值有提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義. </p><p>　　表2獨一味溶劑萃取法和大孔樹脂法分離樣品對小鼠痛閾的影響（略） </p><p>　　Tab 2Effects of samples separated by extraction with solvent and grad

23、ient elution with macroporous adsorptive resin from Lamiophlomis on the pain threshold in mice（略） </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　3.1不同溶劑提取部位與藥效的關(guān)系本試驗對獨一味醇提物水混懸后，用不同極性溶劑由小到大依次萃取，將提取物

24、中所有組分按極性差別分為幾個提取部分. 石油醚部分主要為脂溶性組分［6］；乙酸乙酯部分主要為環(huán)烯醚萜類［2］；正丁醇部分主要為黃酮類及甙類［3,4］；最后水部分主要含糖類. 對各樣品作平行藥效試驗，結(jié)果顯示，正丁醇萃取部分對由醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)有明顯的抑制作用，并可明顯延長扭體反應(yīng)出現(xiàn)時間；但對熱刺激引起的疼痛影響不大；石油醚萃取部分和水部分可減少小鼠扭體次數(shù)，且水部分組對熱刺激引起疼痛在3 h時痛閾值明顯提高；而乙酸乙酯萃取部分對

25、兩種疼痛試驗均無統(tǒng)計學(xué)意義. 從全部結(jié)果看，只有乙酸乙酯組分對兩種疼痛均無效，且各組分仍有強(qiáng)弱差異，一方面因為各組分含有不同化學(xué)成分，導(dǎo)致藥效不同；也可能萃取不完全，組分間含有相似化學(xué)成分，有量的差異而導(dǎo)致藥效強(qiáng)弱. 另一方面，兩種藥理試驗方法可能存在誤差，特別是熱板法，誤差較大，由于動物數(shù)有限，不排除假陽性的可能. </p><p>　　3.2兩種提取方法的比較大孔吸附樹脂在分離、提純中藥有效成分過程中的應(yīng)用日

26、益廣泛，具有選擇性好、吸附容量大、吸附迅速、解吸容易等優(yōu)點，適宜大規(guī)模的中藥現(xiàn)代化生產(chǎn). 本試驗同時選取溶劑萃取法和大孔吸附樹脂分離法分離樣品，并對二者分離的樣品通過TLC鑒別發(fā)現(xiàn)，溶劑萃取法中石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分分別與大孔吸附樹脂分離法中沉淀物部分、900 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分、300 mL&#12539;L-1乙醇洗脫部分、水洗脫部分組分相似. 藥理試驗結(jié)果表明，兩種提取方

27、法中各組分對小鼠扭體反應(yīng)試驗結(jié)果基本一致，但熱板法試驗結(jié)果有較大差異，具體原因有待于進(jìn)一步研究，尋求較佳的大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)換工藝. </p><p>　　3.3建立中藥有效部位篩選方法通過中藥化學(xué)提取分離手段與藥效試驗的緊密結(jié)合，建立了鎮(zhèn)痛中藥有效部位篩選方法，初步完成了獨一味鎮(zhèn)痛有效部位的篩選. 本方法快速、簡便，結(jié)果可靠，下一步將對獨一味鎮(zhèn)痛有效部位中的化學(xué)單體和鎮(zhèn)痛機(jī)制進(jìn)行深入研究. 進(jìn)而建立完整的中藥有效部位

28、篩選的實驗方法. </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ Zeng Y, Chen XJ, Chen ZY. Advances in studies on traditional Tibetan herb Lamiophlomis rotata ［J］. Zhong Cao Yao (Chin Tradit Herbal

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