臭氧和大氣細顆粒物對大鼠心肺系統的影響及其機制研究.pdf

1、大氣環(huán)境中包含多種環(huán)境污染物，其中顆粒物和臭氧是較為常見的污染物。城市中顆粒物在交通高峰期濃度達到最高，臭氧是氮氧化物(NOx)和揮發(fā)性有機物(VOCs)的二次污染物，與光照有關，一般在下午的時候達到最大值。在一天當中，兩者的聯合暴露會發(fā)生，而暴露于多種不同的環(huán)境污染物對健康的損害效應可能比暴露于單一污染物的毒性作用更強，所以無論是對流行病學研究，還是對毒理學的生物機制研究來說，考慮兩者的聯合暴露對健康的影響有重要意義。根據以往的研究結

2、果，既然顆粒物引起的心血管效應機制涉及肺、心臟和血管系統等多個部分，因此我們并行檢測肺、心臟和動脈的改變以評價臭氧和PM2.5暴露對肺、心血管系統的毒性效應及其作用機制。
　　直到目前為止，對于評價人類暴露于多種環(huán)境污染物的健康風險仍然沒有統一的標準。我們的研究中采用亞急性的暴露（2次/周，共3周）來評價由不同劑量的PM2.5單獨暴露或者臭氧與不同劑量PM2.5聯合暴露對Wistar大鼠肺、心血管系統的損傷效應。我們采用每次4小時

3、的0.8ppm臭氧暴露和三個劑量的PM2.5（0.2、0.8和3.2mg/只）暴露。具體的暴露方法是，48只7周齡Wistar大鼠隨機分為8組，每組6只。PM2.5低、中、高劑量組每只動物分別經氣管滴注0.2、0.8和3.2mg的細顆粒物。臭氧和PM2.5聯合暴露低、中、高劑量組為大鼠先暴露于0.8ppm的臭氧4小時，然后再氣管滴注0.2、0.8和3.2mg的細顆粒物。對照組為滴注相同體積(0.20ml)的生理鹽水，臭氧單獨暴露組為先0

4、.8ppm臭氧暴露4小時，然后滴注相同體積的生理鹽水。暴露前和暴露期間每周稱體重一次。暴露3次（暴露中期）24小時后，麻醉動物，進行心電圖(ECG)記錄，分析低頻(LF)、高頻(HF)、低頻/高頻(LF/HF)、總變異(TV)等反應心率變異性(HRV)的參數。末次暴露24小時后，麻醉動物，頸動脈插管測定血壓(BP)，同時進行心電圖(ECG)記錄，分析HRV參數。然后腹主動脈取血處死動物，分別收集全血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)。檢測B

5、ALF中肺炎癥損傷指標:腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和細胞總數及巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的分類計數;肺上皮損傷指標:乳酸脫氫酶(LDH)的活性和堿性磷酸酶(AKP)活性;肺滲透性指標:總蛋白(TP)和白蛋白(TLB);肺組織氧化應激指標:超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力和丙二醛(MDA)含量;肺血管內皮結構與功能指標:實時定量PCR法檢測誘導性一氧化氮合酶(iNOS)、

6、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、和細胞間粘附分子(ICAM-1)mRNA基因表達及比色法測定BALF中一氧化氮(NO)。心臟血管內皮結構與功能指標:實時定量PCR法測定iNOS、eNOS、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和ICAM-1mRNA基因表達;心臟組織內氧化應激指標:SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量。檢測胸主動脈中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表達。測定血清中系統炎癥指標:ELISA法檢測TNF-α、IL-6和C-

7、反應蛋白（CRP），比色測定LDH和肌酸激酶(CK);系統氧化應激指標:血清MDA;內皮結構與功能指標:ELISA法檢測血漿內皮素-1(ET-1)、血清血管內皮生長因子(VEGF)、血清NO含量。取主支氣管、未灌洗的左肺、右心室心室肌和胸主動脈進行HE染色組織學檢查，其中肺組織和心臟組織也通過透射電鏡(TEM)觀察超微結構。分析肺與心血管系統炎癥反應、炎癥反應與氧化應激、炎癥反應與心率變異性和炎癥反應與血管內皮結構與功能之間的相關性。另

8、外，我們也分析了PM2.5單獨暴露和臭氧與PM2.5聯合暴露的肺、心血管毒性的暴露-反應關系及兩種暴露方式的暴露-反應相關性是否一致，進而分析在肺及心血管系統內部及兩者之間的分子病理機制的關聯性、臭氧暴露對顆粒物毒性效應的影響及毒性作用通路的變化。
　　該研究的結果表明，在我們的研究中，臭氧和PM2.5暴露延緩了大鼠體重的增長。PM2.5單獨暴露組的BALF中細胞總數明顯增加。PM2.5的滴注引起肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、

9、LDH和總蛋白含量的明顯增加(P＜0.05)。臭氧單獨暴露沒有引起這些肺損傷指標的顯著變化。但是，臭氧可以提高由PM2.5引起的大鼠肺組織的炎癥和病理改變。與對照組比較，不論是顆粒物的單獨暴露還是與臭氧的聯合暴露，肺組織中SOD和GSH-Px的活力均降低。而肺組織中反應內皮功能的iNOS、eNOS和ICAM-1 mRNA基因表達則有不同的變化，其中，在高劑量的PM2.5單獨暴露組和3個聯合暴露組中iNOS基因表達明顯上調，而eNOS在任

10、何一種暴露方式的作用下均沒有明顯的改變。雖然PM2.5的單獨暴露沒有引起ICAM-1基因表達的明顯改變，但是在臭氧和PM2.5的聯合作用下，肺組織中的ICAM-1表達明顯上調。主支氣管的病理學檢查發(fā)現，除對照組外，其余暴露組均表現出不同程度的炎癥細胞增生、聚集及粘膜上皮細胞的脫落等病理變化。肺組織病理學結果表明，所有PM2.5暴露組均呈現不同程度的炎癥損傷，并隨暴露劑量的增加有加重的趨勢。肺的超微結構觀察發(fā)現PM2.5對肺細胞的損傷主要

11、體現在對肺泡Ⅱ型細胞線粒體的病理影響，即造成線粒體的腫脹、空泡及增多等病變。
　　在對心血管系統的損傷上，與對照組比較，暴露3周后，高劑量PM2.5(3.2mg/只)組的血壓明顯升高(P＜0.05)，心率則無明顯改變。PM2.5單獨暴露組可以引起血清CRP、MDA、 CK、ET-1含量和血壓的明顯增加及HRV參數的顯著降低。大鼠的臭氧單獨暴露沒有引起這些指標的明顯改變。但是，臭氧和PM2.5的聯合暴露引起CRP,IL-6，CK，L

12、DH和MDA劑量-效應趨勢的增加及SOD和HRV以劑量-效應趨勢的降低。同時，在PM2.5單獨暴露及聯合暴露組中，ECG均表現出異常的放電類型。心臟組織病理學檢查發(fā)現，PM2.5暴露組中觀察到顆粒物的沉積，只有在高劑量的聯合暴露組中觀察到心肌炎癥。TEM的結果也表明臭氧單獨暴露、高劑量PM2.5暴露以及兩者的聯合作用可引起超微結構的改變，主要是心肌結構紊亂、肌絲的溶解斷裂、線粒體腫脹和空泡化。另外，PM2.5的單獨及與臭氧的聯合暴露均可

13、以上調動脈中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表達。說明調節(jié)動脈血管結構的轉錄機制和內皮功能受到影響。但是在所有暴露組中，腹主動脈的HE染色結果沒有發(fā)現動脈的明顯病理變化。
　　肺及心血管系統毒性作用機制的關聯性分析表明，肺的炎癥效應、心血管系統的炎癥/氧化應激指標與HRV參數之間存在顯著的相關性。血漿ET-1的含量與大鼠心臟組織中的MMP-2的表達沒有顯著的相關性，但與動脈中MMP-2的表達顯著相關。PM2.5的單獨暴露與臭氧

14、和PM2.5的聯合暴露兩組暴露方式的暴露-反應相關性研究表明，對于檢測顆粒物的肺毒性效應，LDH、總蛋白、白蛋白、iNOS mRNA、SOD、GSH-PX和MDA等指標可能更為敏感，而臭氧對AKP、IL-6、ICAM-1 mRNA等指標的影響較大。兩種暴露方式對心血管系統影響的結果提示，CRP和ET-1等指標對PM2.5暴露較為敏感，而TNF-α、IL-6和TV等指標可能對于臭氧暴露更為敏感一些，VEGF則對PM2.5或臭氧的敏感性都較

15、差。
　　總之，這一暴露劑量(0.8ppm)和暴露時間（2次/周，共3周）的臭氧對肺及心血管系統的損傷較小。高劑量的PM2.5能引起大鼠肺損傷，包括細胞毒性、白細胞浸潤、前炎癥細胞因子、氧化應激以及組織病理變化。大鼠肺的損傷主要由PM2.5所引起，但同時這一效應可被臭氧的聯合暴露所提高。同樣劑量的PM2.5單獨暴露也可以引起心血管系統炎癥和氧化應激損傷、內皮功能和自主神經系統(ANS)的紊亂。臭氧和PM2.5可引起心臟組織和全身系