利用飛行時(shí)間質(zhì)譜簡(jiǎn)便、快速鑒定藍(lán)藻新方法的研究和應(yīng)用.pdf

1、水體富營(yíng)養(yǎng)化與其引發(fā)的藍(lán)藻水華現(xiàn)象以及產(chǎn)生的藻毒素問(wèn)題，對(duì)我國(guó)的水環(huán)境產(chǎn)生了長(zhǎng)期不良的影響與危害，是目前仍舊面臨的一個(gè)難題。在采取治理措施的同時(shí)，必須對(duì)發(fā)生藍(lán)藻水華的水體進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)，并對(duì)其發(fā)生的可能性提前做出預(yù)警，從而制定及時(shí)有效的治理手段。目前，盡管國(guó)內(nèi)外針對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中藍(lán)藻水華的監(jiān)測(cè)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種方法，但是仍缺乏快速、簡(jiǎn)便和精確的監(jiān)測(cè)方法。本研究建立了以核糖體蛋白質(zhì)為生物標(biāo)識(shí)物，以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T

2、OF MS)為測(cè)試手段的鑒別藍(lán)藻新方法，并探討其在藍(lán)藻毒性鑒別與藍(lán)藻多樣性分析的應(yīng)用以及在監(jiān)測(cè)方面應(yīng)用的可能性。
　　首先，本研究通過(guò)對(duì)藍(lán)藻樣品三種前處理方法的篩選，探討使藍(lán)藻樣品的核糖體亞基蛋白質(zhì)在合適的范圍內(nèi)被檢測(cè)到并且信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，以及利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析核糖體蛋白質(zhì)作為鑒別藍(lán)藻的生物標(biāo)識(shí)物的可行性。結(jié)果表明，采用機(jī)械破碎和高速離心的前處理可獲得銅綠微囊藻標(biāo)準(zhǔn)株（Microcystis aeruginosa，NIES-843）

3、的核糖體亞單位，通過(guò)對(duì)核糖體亞單位進(jìn)行MALDI-TOF MS測(cè)定并與其理論計(jì)算值進(jìn)行比較，全部52個(gè)核糖體蛋白質(zhì)中有31個(gè)能夠被成功地檢測(cè)到，其中高頻度且高強(qiáng)度出現(xiàn)的13個(gè)核糖體蛋白質(zhì)（L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20和S14）被選作鑒別藍(lán)藻的特征生物標(biāo)識(shí)物。
　　以建立的測(cè)定方法，對(duì)55株來(lái)自不同采集環(huán)境的M.aeruginosa進(jìn)行測(cè)定和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，同時(shí)利用非

4、加權(quán)組平均法(UPGMA)繪制出系統(tǒng)分類樹(shù)，對(duì)其進(jìn)行種內(nèi)基因多樣性分析。結(jié)果表明，不同M.aeruginosa株的同種核糖體蛋白質(zhì)間存在不同類型(type);55株M.aeruginosa通過(guò)UPGMA分析被分為5個(gè)主要分支(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ)，其中，有毒藻藻株被分類至Ⅰ組和Ⅱ組，而無(wú)毒藻株則被分至Ⅲ-Ⅴ組。此結(jié)果表明利用核糖體蛋白質(zhì)為生物標(biāo)識(shí)物的MALDI-TOF MS鑒別法可以實(shí)現(xiàn)在株水平上對(duì)藍(lán)藻的鑒別并可對(duì)有毒和無(wú)毒的藻株進(jìn)行有

5、效區(qū)分。
　　為了探討所建立的MALDI-TOF MS法在實(shí)際水體中鑒別藍(lán)藻的可行性，先通過(guò)測(cè)定一系列不同細(xì)胞密度的M.aeruginosa NIES-843樣品，確定該方法的敏感性及實(shí)際應(yīng)用中樣品體積的合理性，再通過(guò)測(cè)定4種不同種類的藍(lán)藻在不同濃度下的模擬實(shí)際水體而配成的人工混合樣品，確定該方法從混合物中檢測(cè)出目標(biāo)M.aeruginosa的可行性。結(jié)果表明:MALDI-TOF MS法的最小生物量檢出限為1.955×106cell

6、s，特征核糖體蛋白質(zhì)檢出11個(gè)，檢出率為84.6％，與此相對(duì)應(yīng)的有藍(lán)藻水華發(fā)生的湖泊水體采樣體積為0.1-1L，在日常水質(zhì)監(jiān)測(cè)中屬于合理的采樣體積;同時(shí)，MALDI-TOF MS法對(duì)四種不同種屬的藍(lán)藻配成的人工混合樣品的測(cè)定，證明了銅綠微囊藻NIES-843可以被有效地檢測(cè)出，最低生物量檢出限為2.88×106cells，相對(duì)應(yīng)的混合樣品3中M.aeruginosa的占比為37％，特征核糖體蛋白質(zhì)的檢出率為76.9％。
　　最后，

7、將基于13個(gè)特征核糖體蛋白質(zhì)為生物標(biāo)識(shí)物的MALDI-TOF MS法對(duì)采集于太湖夏季的四個(gè)不同地點(diǎn)的實(shí)際水樣進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明，實(shí)際太湖樣品1和4中能檢測(cè)出9個(gè)特征標(biāo)識(shí)峰，檢出率為69.2％，太湖樣品2和3中則能檢測(cè)出11個(gè)特征標(biāo)識(shí)峰，檢出率為84.6％;同時(shí)，來(lái)自太湖的實(shí)際水樣中同種核糖體蛋白質(zhì)的不同類型也被檢測(cè)到(L32，L35，L29，L28和S14)，即在太湖不同地點(diǎn)存在不同株型的銅綠微囊藻，揭示了株水平上的多樣性。