海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)深度解析新方法及其應(yīng)用.pdf

1、生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了重要的技術(shù)支持,特別是液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)憑借其高靈敏度、高通量和高精度的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定的主要技術(shù)。然而,隨著質(zhì)譜儀檢測速度和檢測精度的提高,質(zhì)譜產(chǎn)出的數(shù)據(jù)也成倍增加,如何正確解析這些質(zhì)譜數(shù)據(jù)成為蛋白組學(xué)研究的一大挑戰(zhàn)。為滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究中海量數(shù)據(jù)解析的需求,自動化分析流程是不可缺少的,目前主要的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析方式是通過蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,然而常用數(shù)據(jù)

2、庫搜索方式對串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)譜圖的解析能力有限,即使對于高精度的質(zhì)譜數(shù)據(jù)而言,譜圖的解析率亦不超過30％。影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的因素是多方面的,包括樣本本身的復(fù)雜程度、樣本制備過程引入的不確定因素以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和分析過程的不同等。
　　為了降低質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析過程中各種因素的影響,通常以標(biāo)準(zhǔn)品作為參考,規(guī)范和評價質(zhì)譜數(shù)據(jù)的產(chǎn)生與分析流程。其中由于合成肽段具備序列信息明確,樣本構(gòu)成簡單,不易受外界污染物影響等特點(diǎn),能夠作為質(zhì)譜性能評價和數(shù)據(jù)分

3、析方法評價的參考物質(zhì),因此,本文以化學(xué)合成肽段作為標(biāo)準(zhǔn)品,分別從質(zhì)譜儀的掃描精度、質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置、樣本的復(fù)雜程度以及數(shù)據(jù)處理等方畫深入分析了影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的因素。該標(biāo)準(zhǔn)品共包含30個質(zhì)譜響應(yīng)較好的特征肽段,分別來源于騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis,TTE)表達(dá)豐度不同的15個蛋白質(zhì),且與酵母蛋白質(zhì)序列同源性較小,可用于構(gòu)建以酵母為基體的復(fù)雜體系樣本。通過對合成肽段的色譜與質(zhì)譜表征,表

4、明30個合成肽段樣本色譜純度均達(dá)99%以上,且肽段含量較高,序列合成正確,適合于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品。
　　通過標(biāo)準(zhǔn)肽段的高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表明串聯(lián)質(zhì)譜掃描中一級質(zhì)譜儀的分辨率提高雖然能夠提供準(zhǔn)確的一級母離子的質(zhì)量數(shù),但受儀器本身固有特征與參數(shù)設(shè)置的影響,僅僅依賴質(zhì)譜選擇的母離子并不一定能夠使所有二級譜圖得到鑒定。其中,離子動態(tài)排除和較寬的離子解離窗口設(shè)置是產(chǎn)生這一現(xiàn)象的重要原因,兩者共同作用容易導(dǎo)致較寬質(zhì)荷比范圍內(nèi)的所有離子共碎裂產(chǎn)

5、生混合譜圖。隨著檢測樣本復(fù)雜程度的增加,混合譜圖的比列也顯著增高,而混合譜圖的低解析率成為影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析率的重要因素之一。
　　為了提高譜圖的正確鑒定率,本研究以混合譜圖作為主要研究對象,深入分析其譜圖的特征,并利用這些特征對混合譜圖進(jìn)行鑒定。經(jīng)過對大量質(zhì)譜譜圖的分析.發(fā)現(xiàn)造成混合譜圖解析率低的原因主要包括兩部分,一是不能正確識別形成混合譜圖的所有母離子單同位素峰,二是混合譜圖中未鑒定碎片離子的影響。針對第一種原因,本研究提出了

6、一種基于同位素峰強(qiáng)度比值的單同位素峰識別算法(Peak intensity ratio-based monoisotopic peak determination algorithm,PIRMD),該算法首先利用相鄰?fù)凰胤宓膹?qiáng)度比值對母離子單同位素峰的邊緣特征進(jìn)行分析,并利用該特征識別未發(fā)生同位素峰混疊的母離子的單同位素峰,其次對于產(chǎn)生混疊的母離子的單同位素峰,通過構(gòu)建實(shí)驗(yàn)同位素峰分布與理論分布之間的誤差函數(shù)加以識別。對標(biāo)準(zhǔn)品樣本與復(fù)

7、雜蛋白質(zhì)樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析表明,PIRMD能夠較為有效地提高質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析率,其中復(fù)雜樣本鑒定結(jié)果表明解析質(zhì)譜圖的25%來自混合譜圖。針對第二種原因,本研究從反轉(zhuǎn)譜圖的思想出發(fā),充分利用高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)中一級掃描的高準(zhǔn)確度與二級掃描碎片離子的互補(bǔ)特征,提出了一種基于碎片離子對的混合譜圖分離算法(Chimera identification algorithm based on fragmention pairs,CHIFP)。通過對理論參

8、考數(shù)據(jù)集的鑒定結(jié)果分析,CHIFP算法能夠在正確識別混合譜圖母離子的前提下,可將母離子強(qiáng)度較低的混合譜圖解析率提高絢20%。標(biāo)準(zhǔn)肽段數(shù)據(jù)集與騰沖嗜熱厭氧菌蛋白質(zhì)樣本數(shù)據(jù)集的鑒定結(jié)果表明,與PIRMD相比,CHIFP并沒有顯著提高總譜圖的鑒定率(僅提高1～2%),但TTE蛋白質(zhì)樣本的肽段鑒定結(jié)果與蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果證明,CHIFP可有效增加對混合譜圖的解析能力,受此影響的肽段鑒定數(shù)目增加了4%,而蛋白質(zhì)鑒定數(shù)則增加了約10%,且經(jīng)該算法過濾后