色譜分析技術(shù)

1、第二篇 色譜分析技術(shù),一、色譜法的起源、發(fā)展及定義,概 述,一、色譜法的起源、發(fā)展及定義,柱色譜→薄層色譜和紙色譜→氣相色譜→毛細(xì)管柱色譜→高效液相色譜→薄層掃描儀→毛細(xì)管電泳→色譜-光譜聯(lián)用、多維色譜、智能色譜。,,液相色譜（經(jīng)典）,氣 質(zhì) 聯(lián) 用,又稱層析法，是一種依據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)（溶解性、極性、離子交換能力、分子大小等）的不同，當(dāng)流動(dòng)相攜帶樣品流經(jīng)固定相時(shí)，樣品各組分在兩相中不斷的重新分配，最終達(dá)到分離與提純，以便于對(duì)樣品

2、進(jìn)行定性和定量分析的分析方法。,一、色譜法的起源、發(fā)展及定義,二、色譜法的分類,按兩相狀態(tài)不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過(guò)程的原理不同分類,,按兩相狀態(tài)不同分類,色譜其中的一相固定不動(dòng)，稱為固定相; 另一相是攜帶試樣混合物流過(guò)此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動(dòng)相。,兩 相狀 態(tài),,,流動(dòng)相的物態(tài),液相色譜（LC）氣相色譜（GC）,二、色譜法的分類,按兩相狀態(tài)不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過(guò)程的原理不

3、同分類,,按操作方法不同分類,柱色譜,紙色譜,薄層色譜,二、色譜法的分類,按兩相狀態(tài)不同分類按操作方法不同分類按色譜分離過(guò)程的原理不同分類,,按色譜分離過(guò)程的原理不同分類,（1）吸附色譜（2）分配色譜（3）離子交換色譜（4）分子排阻色譜（凝膠色譜法),三、色譜過(guò)程,四、色譜曲線相關(guān)術(shù)語(yǔ),W：峰寬,Wh/2：半峰寬,tR：保留時(shí)間,t0：死時(shí)間,tR，：調(diào)整保留時(shí)間,,色譜峰,,基線,第七章 薄層色譜法,薄層色譜是在平面上進(jìn)行

4、分離的一種方法，又叫平面色譜法。通常將固定相(吸附劑)均勻地涂鋪在表面潔凈的玻璃、塑料或金屬板形成薄層，制成薄板，進(jìn)行樣品分離。,特點(diǎn)：快速 靈敏（用量?。?高選擇性（如同分異構(gòu)體） 簡(jiǎn)便 顯色方便 應(yīng)用廣泛：化合物的鑒別和少量化合物的分離 用于檢測(cè)藥品含量

5、 藥物合成中用于鑒別反應(yīng)程度和監(jiān)控反應(yīng)歷程 用于摸索高效液相的色譜條件,(一)吸附色譜分離原理利用吸附劑對(duì)不同成分吸附力的大小及展開(kāi)劑解吸附作用的差異進(jìn)行分離。吸附牢的組分隨展開(kāi)劑移動(dòng)慢，吸附弱的組分隨展開(kāi)劑移動(dòng)快，一段時(shí)后，組分被分離。固定相:固體吸附劑流動(dòng)相:液體展開(kāi)劑,一、基本原理,第一節(jié) 薄層色譜法的基本原理,（

6、1）比移值Rf：,Rf是薄層色譜法基本定性參數(shù)，一定條件時(shí)Rf為定值，在0～1之間，可用范圍Rf值在0.2～0.8之間。組分極性越大，Rf越小,反之越大。,（二）比移值與相對(duì)比移值,（2）相對(duì)比移值Rs：為消除系統(tǒng)誤差,Rf<1,　Rs不一定小于1。,（二）比移值與相對(duì)比移值,二、吸附薄層色譜中吸附劑與展開(kāi)劑,常用的吸附劑：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭和大孔吸附樹(shù)脂等。吸附劑的選擇要合適，與流動(dòng)相、被分離化合物不反應(yīng),（一）吸附劑

7、（固定相）的選擇,（1）硅膠：極性吸附劑，應(yīng)用范圍廣 物理吸附為主，氫鍵吸附為輔 微酸性，不直接用于堿性成分的分離 機(jī)械強(qiáng)度好，適用于薄層色譜 吸附容量大，與羥基數(shù)目有關(guān)常用硅膠的規(guī)格：硅膠H，硅膠G，硅膠GF254等,（2）氧化鋁：a.極性吸附劑，較硅膠強(qiáng)。 b.物理吸附為主，氫鍵吸附為輔 c.

8、微堿性，不直接用于酸類成分的分離,堿性氧化鋁：適用于碳?xì)浠衔?、生?堿以及其它堿性化合物的分離。中性氧化鋁：應(yīng)用最廣，適用于醛、酮、 醌以及酯類化合物的分離。 酸性氧化鋁：適用于有機(jī)酸類的分離。,硅膠和氧化鋁含水量越高，吸附活性越弱。 只要在110℃左右加熱，這些“自由水” 就能被可逆性地除去。利用這一原理可以對(duì)吸附劑進(jìn)行活化（去水）和脫活化（加水）處理，以控制吸附

9、劑的活性。,硅膠、氧化鋁的含水量與活性級(jí)別,硅膠、氧化鋁薄層：被分離物質(zhì)極性越大，越易被吸附。一般規(guī)律：（1）官能團(tuán)極性越大，整個(gè)分子極性越大，越易被吸附；（2）形成分子內(nèi)H鍵時(shí)，被吸附力減弱；（3）同系物中，分子量越大，極性越小，被吸附力越弱。常見(jiàn)官能團(tuán)極性順序： 烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<酯類<酮類 <醛類<硫醇<胺類<醇類<酚類

10、<羧酸類,被分離物質(zhì)極性與吸附能力的關(guān)系,（二）展開(kāi)劑（流動(dòng)相）的選擇,硅膠、氧化鋁薄層：展開(kāi)劑的極性越大，其展開(kāi)能力越強(qiáng)，化合物在色譜中移動(dòng)的速度就越快，表現(xiàn)為Rf 增大。,常用溶劑極性大小,石油醚＜環(huán)已烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯 ＜乙醚＜三氯甲烷（氯仿）＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水,選擇原則：被分離成分極性大展開(kāi)劑極性大被分離成分極性小展開(kāi)劑極性小,吸附劑、展開(kāi)劑選擇規(guī)律,考慮三方面因素：被分離組分極性，吸附劑活性

11、、洗脫劑極性。,活潑,不活潑,吸附劑（固定相）,展開(kāi)劑（流動(dòng)相）,被分離物質(zhì),B,B’,A,C,C’,極性,非極性,非極性,極性,,,,,,,,,A’,Ⅴ,Ⅰ,,,,,,,硅膠薄層色譜規(guī)律總結(jié),第二節(jié) 薄層色譜系統(tǒng)簡(jiǎn)介第三節(jié) 操作方法及注意事項(xiàng),略：在操作方法中部分介紹一、儀器的性能檢定二、背景干擾的消除三、樣品測(cè)定操作方法,1、薄層板的制備 2、點(diǎn)樣3、展開(kāi) 4、顯色和定位5、薄層掃描儀對(duì)斑點(diǎn)

12、掃描,1、薄層板的制備,要求：玻璃板需光潔，否則吸附劑易脫落； 大小由需求決定。,薄層板分類和制法,軟板的制備硬板的制備 傾注法 平鋪法 機(jī)械涂布法,,,,1、薄層板的制備,（1）軟板的制備,軟板：直接將吸附劑鋪在玻璃板上制成，不加粘合劑,3.橡皮膏 4.橡皮管,要求：厚度→隨分離要求而定，一般0.25～0.5mm 玻璃棒推動(dòng)速度不宜過(guò)快、也不

13、應(yīng)停頓→影響厚度均一性優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便、隨用隨鋪、展開(kāi)速度快。缺點(diǎn)：吸附劑易脫落、只能用近水平展開(kāi)，效果差。,薄層板分類和制法,軟板的制備硬板的制備 傾注法 平鋪法 機(jī)械涂布法,,,,1、薄層板的制備,（2）硬板的制備,硬板：吸附劑加粘合劑制成的板,常用的粘合劑：煅石膏（Ｇ） 機(jī)械強(qiáng)度差，易脫落，但不易腐蝕　　　　　　　羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）

14、 機(jī)械強(qiáng)度好，不易脫落，但易腐蝕且,a、傾注法：硅膠G或氧化鋁G，直接加水調(diào)成糊狀硅膠或氧化鋁，加羧甲基纖維素鈉水溶液調(diào)成糊狀,,,倒在玻璃板上,,均勻鋪開(kāi)、振蕩、晾干、活化、置干燥器中備用。,（2）硬板的制備,b、平鋪法：,1. 吸附劑薄層 2. 涂布器 3. 玻璃夾板4. 玻璃板 5. 玻璃夾板,過(guò)程：制板→振蕩→晾干→活化→備用優(yōu)點(diǎn)：一次鋪多塊薄層板，簡(jiǎn)單易行。,（2）硬板的制備,c

15、、機(jī)械涂布法：,優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單方便、薄板厚度均勻、分離效果好。,手動(dòng)涂布器 全自動(dòng)涂布器,常用的薄層板：軟板：硅膠H板、氧化鋁H板硬板：常用的有硅膠G板、氧化鋁G板、硅膠CMC-Na板、氧化鋁CMC-Na板、硅膠GF 、硅膠GF,2、點(diǎn)樣,（1）樣品溶液的制備： 怎樣選擇溶劑？ 水可以用嗎？,2、點(diǎn)樣,（2）點(diǎn)樣量： 與薄層板的關(guān)系 太多太少的影響,點(diǎn)樣基線：距底邊2.0c

16、m樣點(diǎn)直徑：2-4mm點(diǎn)間距離：1.5-2.0cm,2、點(diǎn)樣,（3）點(diǎn)樣方法： 劃線、樣品記號(hào)點(diǎn)、點(diǎn)樣 注：動(dòng)作要輕， 毛細(xì)管或點(diǎn)樣器不能混用， 斑點(diǎn)大小適當(dāng)，可多次點(diǎn)樣。,平頭50ul微量點(diǎn)樣器,全自動(dòng)點(diǎn)樣儀,3、展開(kāi),展開(kāi)缸（色譜缸）,3、展開(kāi),（1）展開(kāi)方式：,a、近水平展開(kāi),特點(diǎn)：速度快、適用于軟板的展開(kāi)。,3、展開(kāi),（1）展開(kāi)方式：,b、上行展開(kāi),過(guò)程：預(yù)飽和（濾紙貼于展開(kāi)槽

17、內(nèi)側(cè)）、展開(kāi)、標(biāo)記溶劑前沿,c、單向二次展開(kāi)d、雙向二次展開(kāi),3、展開(kāi),（1）展開(kāi)方式：,3、展開(kāi),（2）注意事項(xiàng)：,a、色譜槽需密閉良好脂溶性展開(kāi)劑：甘油淀粉糊水溶性展開(kāi)劑：凡士林b、注意防止邊緣效應(yīng),4、顯色和定位,一般規(guī)律：日光下觀察、紫外燈下觀察、加顯色劑加顯色劑：多噴霧，軟板使用浸漬顯色法,紫外燈觀察,噴顯色劑觀察,5、薄層掃描儀對(duì)色譜斑點(diǎn)進(jìn)行掃描,用一束長(zhǎng)寬可以調(diào)節(jié)的一定波長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的光照射到薄層斑點(diǎn)上進(jìn)行整個(gè)斑

18、點(diǎn)的掃描，用儀器測(cè)量通過(guò)斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束強(qiáng)度的變化從而達(dá)到定量的目的。,判斷依據(jù)：Rf值、Rs值,1、查找資料：影響Rf值的因素 吸附劑種類、活度、顆粒大?。徽归_(kāi)劑純度和極性；薄層厚度；點(diǎn)樣量；展開(kāi)方式、溫濕度；展開(kāi)槽中的預(yù)飽和狀態(tài)等。2、對(duì)照品比較法：常用。,四、結(jié)果計(jì)算和判斷（一）定性鑒別,1、對(duì)照品比較法：,雜質(zhì)對(duì)照品制成一定濃度的溶液,樣品制成一定濃度溶液,,按相同的點(diǎn)樣量點(diǎn)樣,,,展開(kāi)后觀察斑點(diǎn)顏色深淺和大小

19、,（二）雜質(zhì)檢查（雜質(zhì)限量檢查）,如異煙肼中游離肼的檢查： 肼是一種誘變劑和致癌物質(zhì)，中國(guó)藥典對(duì)異煙肼原料和注射用異煙肼中游離肼的檢查均采用薄層色譜法。 檢查方法　取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作為供試品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相當(dāng)于游離肼50μg）的溶液，作為對(duì)照溶液。吸取供試液10μl 與對(duì)照溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板（用羧甲基纖維素鈉溶液制備）上，以異丙醇－丙酮（3:

20、2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾干，噴以乙醇制對(duì)二甲氨基苯甲醛試液，15min后檢視，在供試品主斑點(diǎn)前方與硫酸肼斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，不得顯黃色斑點(diǎn)。,2、自身稀釋對(duì)比法（雜質(zhì)結(jié)構(gòu)不明或無(wú)雜質(zhì)對(duì)照品）,樣品溶液稀釋制成一定濃度的溶液,樣品制成一定濃度溶液,,按相同的點(diǎn)樣量點(diǎn)樣,,,展開(kāi)后觀察斑點(diǎn)顏色深淺和大小,（二）雜質(zhì)檢查（雜質(zhì)限量檢查）,如地西泮中有關(guān)物質(zhì)的檢查： 取本品的細(xì)粉適量（約相當(dāng)于地西泮200mg），加丙酮5ml,振搖，使地西

21、泮溶解，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液；精密量取適量，加丙酮稀釋成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作為對(duì)照溶液。點(diǎn)樣展開(kāi)后，供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)比較，不得更深。,1、目視比較法：,對(duì)照品制成不同濃度的系列溶液,樣品制成定量溶液,,按相同的點(diǎn)樣量點(diǎn)樣,,,展開(kāi)后觀察斑點(diǎn)顏色深淺和大小,注：本法適用于近似含量的測(cè)定，誤差±10%,（三）含量測(cè)定,2、斑點(diǎn)洗脫法,對(duì)照品制成溶液 點(diǎn)于薄板兩側(cè),

22、樣品制成一定濃度溶液 線狀點(diǎn)于薄板起始線中間部分,,,展開(kāi),,,,,對(duì)對(duì)照品顯色，以此為依據(jù)刮下含有樣品的吸附劑,,,,,將樣品溶解，按照分光光度法測(cè)定溶液濃度,（三）含量測(cè)定,3、薄層掃描法,（三）含量測(cè)定,（1）外標(biāo)法 用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，求

23、出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。 此法要求點(diǎn)樣量準(zhǔn)確相同。,取本品水蜜丸6g，研碎，或取小蜜丸或大蜜丸9g，切碎，加硅藻土4g，研勻。加乙醚40ml，低溫回流1小時(shí)，濾過(guò)，濾液揮去乙醚，殘?jiān)颖?ml使溶解，作為供試品溶液。

24、另取丹皮酚對(duì)照品，加丙酮制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl,分別點(diǎn)于同一硅膠Ｇ薄層板上，以環(huán)己烷－醋酸乙酯(3:1) 為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以鹽酸酸性 5％三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)褐色斑點(diǎn)。 （2005年版《中國(guó)藥典》一部 401頁(yè)）,一、六味地黃丸中丹皮酚的薄層鑒別,第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例,1.丹

25、皮酚；2～5.六味地黃丸,六味地黃丸中牡丹皮的薄層圖譜,二、醋酸可的松中其他甾體的檢查,,取本品，加氯仿-甲醇(9︰1) 制成每1ml 中含10mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加氯仿-甲醇(9︰1) 稀釋成每1ml 中含0.10mg的溶液，作為對(duì)照溶液。照薄層色譜法（附錄Ⅴ B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠Ｇ薄層板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385︰6

26、0︰15︰2) 為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾干，在105 ℃干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍(lán)試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，不得多于3 個(gè)，其顏色與對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)比較，不得更深。,三、硫酸長(zhǎng)春堿中雜質(zhì)的限量檢查,,《中國(guó)藥典》(2005年版)規(guī)定硫酸長(zhǎng)春堿中其他生物堿的檢查方法如下：取本品，加甲醇制成10mg/ml溶液作為供試溶液。精密吸取適量加甲醇制成0.02mg/ml溶液作為對(duì)照液。取上述兩溶液各

27、5μl點(diǎn)于同一硅膠GF254薄板上，展開(kāi)，檢識(shí)；供試溶液中的雜質(zhì)斑點(diǎn)不得超過(guò)兩個(gè)，且顏色不得深于對(duì)照溶液主斑點(diǎn)的顏色。,四、鹽酸氯丙嗪中有關(guān)物質(zhì)的限度檢查,,有關(guān)物質(zhì)（吩噻嗪類其他取代物） 避光操作。取本品，加甲酸制成每1ml中含10mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加甲醇稀釋成每1ml中含0.1mg的溶液，作為對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮-二乙胺（8