1、實驗四 細(xì)菌的簡單染色與革蘭氏染色,一、目的要求,1、學(xué)習(xí)細(xì)菌染色的原理和方法;2、掌握細(xì)菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。,二、基本原理,用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷,能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點較低,當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負(fù)電荷,所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷,能與帶正電荷的
2、物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時,細(xì)菌所帶正電荷增加,因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料,如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。,簡單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài),簡單染色不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩大類,是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法
3、所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌,是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。,革蘭氏陽性和陰性菌細(xì)胞壁成分比較,成分 占細(xì)胞壁干重的% 革蘭氏陽性菌 革蘭氏陰性菌肽聚糖 含量很高(50-90) 含量很低(~10)磷壁酸 含量較高(<50) 無類脂質(zhì) 一般無( < 2)
4、 含量較高(~20)蛋白質(zhì) 無 含量較高,,,,,G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì),而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低,故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì),增加了細(xì)胞壁的通透性,使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出,結(jié)果細(xì)菌就被脫色,再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G?菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高,類脂質(zhì)含量少,經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細(xì)菌
5、仍保留初染時的顏色。,三、實驗器材,1、菌種 培養(yǎng)12-16h的枯草桿菌(Bacillus subtilis),培養(yǎng)24小時的大腸桿菌(Escherichia coli)2、染色液和試劑 草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、95%乙醇、蕃紅、復(fù)紅、二甲苯、香柏油3、器材 廢液缸、洗瓶、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。,四、實驗方法及步驟,1、簡單染色(1)涂片 取干凈載玻片一塊,在載玻片的左、右各加一滴蒸餾
6、水,按無菌操作法取菌涂片,左邊涂蘇云金桿菌,右邊涂大腸桿菌,做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環(huán)涂在左邊制成薄的涂面,將大腸桿菌的濃菌液取2-3環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面,注意取菌不要太多。,(2)晾干 讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。(3)固定 手執(zhí)玻片一端,讓菌膜朝上,通過火焰2-3次固定(以不燙手為宜)。(4)染色 將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上, 加
7、復(fù)紅染色1-2min。(5)水洗 用水洗去涂片上的染色液。(6)干燥 將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。(7)鏡檢 先低倍觀察,再高倍觀察,并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出,在涂片上加香柏油一滴,將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。,,,涂片,干燥,固定,,染色,水洗,鏡檢,簡單染色方法,,,干燥,2、革蘭氏染色,(1)涂片 與簡單染色涂片相同;(2)晾干 與簡單染色法相同;(3)
8、固定 與簡單染色法相同;(4)初染 將玻片置于廢液缸玻片擱架上,加適量(以蓋滿細(xì)菌涂面)的結(jié)晶紫染色液染色1min;(5)水洗 傾去染色液,用水小心地沖洗;,(6)媒染 滴加盧哥氏碘液,媒染1min;(7)水洗 用水洗去碘液;(8)脫色 將玻片傾斜,連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-25s至流出液無色,立即水洗;(9)復(fù)染 滴加蕃紅復(fù)染5min;(
9、10)水洗 用水洗去涂片上的蕃紅染色液;(11)晾干 將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干;(12)鏡檢 鏡檢時先用低倍,再用高倍,最后用油鏡觀察,并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。,五 注意事項,1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度,革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌;如脫色時間過短,革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響,
10、難以嚴(yán)格規(guī)定,需要多加練習(xí);2、選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h,E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老,由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。,六 實驗報告,1、結(jié)果(1) 繪制簡單染色的細(xì)菌個體形態(tài)圖;(2) 繪制Bacillus subtilis和Escherichia coli的形態(tài)圖,并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。2、思考題 當(dāng)對未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時,如何保證操作正確及結(jié)果可靠?,球菌,肺炎鏈球
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